この技術は、迅速な回転楕円体の生成のための先駆的なシステムであるLab-on-a-CDプラットフォームを使用して、個々および複数の細胞タイプから細胞回転楕円体を生成するために使用することができます。この技術は遠心力を使用して細胞を指定されたマイクロウェルに沈着させ、多様なスフェロイドの製造のために複数の細胞タイプの昇順を可能にする。CMS培養チップ製造の場合は、まず、コンピュータ数値制御加工により培養チップの上層と底層にポリカーボネート金型を作ります。
次にPDMS塩基とPDMS硬化剤を10対1の比率で5分間混合してから、1時間デシケータに入れ、気泡を除去した。脱気PDMS混合物をCMS培養チップ金型に注ぎ、カビをデシケーターに1時間置いて気泡を取り除きます。2回目の脱気の終わりに、80°Cの熱室で2時間混合物を治してから、表面を上に接着する真空プラズマクリーナーにチップを入れます。
培養チップを18ワットの電力で30秒間空気アシストプラズマに露出し、熱室の2層を80°Cで30分間接着して接着強度を高めます。その後、15分間摂氏121度でオートクレーブでCMS培養チップを殺菌します。スフェロイド形成のために細胞を調製するために、穏やかな混合で細胞に1ミリリットルのDMEMを加える前に、摂氏36.5度の水浴中の5つの細胞に5〜10倍10倍を含む1ミリリットルバイアルを解凍する。
次に、36.5°C培地の15ミリリットルを含む直径150ミリメートルのペトリ皿に細胞を加え、24時間細胞培養インキュベーターに皿を入れます。翌日、上清を15ミリリットルの新鮮なDMEMに置き換え、細胞をインキュベーターに戻します。細胞を取り外すには、摂氏36.5度と5%の二酸化炭素で4分間トリプシンを4ミリリットルで培養し、細胞が皿の底から持ち上がったときに新鮮な培地との反応を止める。
細胞にラベルを付けるには、20マイクロリットルの無水ジメチルスルホキシドをバイアルに加える前に適切な蛍光色素を室温に温め、1ミリモル溶液を得る。DMEMで1マイクロモルの最終的な作業濃度に蛍光を希釈し、穏やかな混合で目的の細胞懸濁液に色素を加えます。その後、細胞を培養インキュベーターに20分間入れます。
単一培養スフェロイド形成の場合、まず、1分間に500~1,000回転でチップを回転させながら、CMS培養チップの入口穴に4%プルロンニックF-127溶液の2.5ミリリットルを加える。すべてのソリューションが追加されたら、CMSシステムを使用して1分間に4,000回転でチップを3分間回転させます。回転の終わりに、培養チップを摂氏36.5度で一晩5%の二酸化炭素でインキュベートする。
翌朝、Pluronic溶液を取り出し、DMEMで培養チップを洗浄します。クリーンベンチでチップを12時間乾燥させた後、2.5ミリリットルの媒体を入口ポートに加え、チップを毎分4,000回転で3分間回転させます。回転の終わりに、チップが毎分500〜1,000回転で回転している間、入口ポートの媒体の100マイクロリットルを準備されたセル懸濁液の100マイクロリットルに置き換えます。
次いで、チップを毎分3,000回転で3分間回転させ、各マイクロウェルの細胞を遠心力でトラップしてから、細胞培養インキュベーターにチップを3日間入れ、毎日実証されるように培地をリフレッシュする。同心円球共培養の生成では、チップが500〜1,000回転で回転している間に、100マイクロリットルの培地中の細胞の最初の集団をチップの入口ポートに追加し、その後毎分3,000回転で3分回転します。回転の終わりに、チップが毎分500〜1,000回転で回転している間に2番目の細胞集団の100マイクロリットルを加え、さらに3分間毎分3,000回転でチップを回転させます。
両方の量の細胞が注入されたら、チップを細胞培養インキュベーターに1,000~2,000回転/分で24時間置きます。ヤヌススフェロイド形成の場合、チップが500〜1、毎分000回転、3分で3分、毎分3分回転している間、細胞の最初の集団の100マイクロリットルを追加します。回転の終わりに、細胞培養インキュベーターにチップを入れ、1,000~2,000回転/毎分3時間回転します。
インキュベーションの終わりに、細胞の2番目の集団の100マイクロリットルを加え、チップは毎分500〜1,000回転で回転し、チップを毎分3,000回転で3分間回転させます。次に、細胞培養インキュベーターに1,000~2,000回転/毎分24時間置きます。サンドイッチスフェロイド形成の場合、最初のセル集団の100マイクロリットルを追加し、チップは1分あたり500〜000回転で回転し、次に毎分3,000回転で3分回転します。
回転の終わりに、チップを1分あたり1,000〜2,000回転で細胞培養インキュベーターの回転子に2時間置き、チップが毎分500〜1,000回転で回転している間に細胞の2番目の集団の100マイクロリットルを加える。チップを3,000 RPMで3分間回転させ、チップをインキュベーターに戻して3時間回転させます。次に、チップが毎分500〜1,000回転で回転する間、最初の細胞集団の100マイクロリットルを追加し、ちょうど12時間実証したように細胞を回転させて培養します。
実証されたプロトコルに従って、直径6センチのCMS培養チップを正常に製造することができます。CMS培養チップのチャネルは、入口ポート、中央、スライド、マイクロウェル領域から構成されます。示されるように、個々のCMSチップ内の培養の最初の24時間に対して毎分2,000回転で撮影された2種類の細胞培養のタイムラプス画像は、示されるように、スフェロイドの形成に成功したことを示す。
培養3日後のマイクロウェルのイメージングは、スフェロイドが優れた均一性および球形性を示していることを示す。コレントリクス、ヤヌス、サンドイッチ構造を用いた共培養スフェロイドも生成可能です。さらに、7日間高重力にさらされた細胞培養は、生きた/死んだ染色に続いて、ほとんどの細胞がチップ内の長期培養を生き残ることを示している。
CMS培養チップの上層と底部の層は、結合時に慎重に整列する必要があり、そうでなければ、各マイクロウェル内の細胞の数が等しくない可能性があります。この研究は、コカルチャースフェロイド研究の参入障壁を下げることができ、例えば、関心のある新薬をスクリーニングするために、コカルチャー研究で広く使用することができる。
