이 기술은 빠른 스페로이드 생성을 위한 선구적인 시스템인 LAB-on-a-CD 플랫폼을 사용하여 개별 및 다중 세포 유형에서 셀 스페로이드를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 원심력을 사용하여 세포를 지정된 마이크로웰에 증착하여 다양한 스페로이드 생산을 위해 여러 세포 유형의 순차적 고리를 허용합니다. CMS 배양 칩 제조의 경우 먼저 컴퓨터 수치 제어 가공에 의해 배양 칩의 상단 및 하단 층에 폴리 카보네이트 금형을 만듭니다.
다음 혼합 PDMS 베이스와 PDMS 경화 제는 기포를 제거하기 위해 1 시간 동안 건조기에 혼합물을 배치하기 전에 5 분 동안 10 대 1 비율로. 탈가스 PDMS 혼합물을 CMS 배양 칩 몰드에 붓고 금형을 건조기에 1시간 더 넣고 기포를 제거합니다. 두 번째 탈가싱이 끝나면, 2시간 동안 80°C의 열챔버에서 혼합물을 치료한 후, 칩을 진공 플라즈마 클리너에 넣고 표면을 향하게 한다.
배양 칩을 공기 보조 플라즈마에 30초 동안 18와트의 힘으로 노출하고, 열챔버의 칩 의 두 층을 섭씨 80도에서 30분간 결합하여 접착 강도를 높입니다. 그런 다음 CMS 배양 칩을 121°C에서 15분간 소독합니다. 스페로이드 형성을 위해 세포를 준비하기 위해, 부드러운 혼합으로 세포에 DMEM의 1 밀리리터를 추가하기 전에 2 분 동안 관심있는 5 세포에 5 ~ 10 배 10 배 10 번 10 번 함유 된 1 밀리리터 바이알을 해동하십시오.
다음으로 세포를 직경 150mm의 페트리 접시에 넣고 섭씨 36.5도의 15밀리리터를 함유하고 24시간 동안 세포 배양 배양 인큐베이터에 접시를 넣습니다. 다음 날, 상체를 신선한 DMEM의 15 밀리리터로 교체하고 세포를 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 세포를 분리하려면 섭씨 36.5도에서 4분간 트립신 4밀리리터와 이산화탄소 5%로 배양을 생성하여 세포가 접시 바닥에서 들어올릴 때 신선한 배지로 반응을 멈춥시다.
세포에 라벨을 붙이기 위해, 1밀리알 용액을 얻기 위해 유리병에 무수성 디메틸 설산화물20 마이크로리터를 추가하기 전에 적절한 세포 형광 염료를 실온으로 데우도록 한다. DMEM에서 하나의 마이크로몰러의 최종 작동 농도로 형광을 희석하고 부드러운 혼합으로 관심있는 세포 현탁액에 염료를 추가합니다. 그런 다음 세포를 세포 배양 인큐베이터에 20 분 동안 배치하십시오.
단일문화 스페로이드 형성의 경우, CMS 배양 칩의 입구 구멍에 4%의 Pluronic F-127 용액의 2.5 밀리리터를 분당 500~1, 000 회전으로 회전하는 동안 먼저 추가하십시오. 모든 솔루션이 추가되면 CMS 시스템을 사용하여 분당 4, 000 회전에서 칩을 회전합니다. 회전이 끝나면, 이산화탄소 5%에서 섭씨 36.5도에서 하룻밤 사이에 배양 칩을 배양한다.
다음 날 아침, 플로론 솔루션을 제거하고 DMEM으로 배양 칩을 세척하십시오. 깨끗한 벤치에서 12시간 동안 칩을 건조한 후, 중간 크기의 2.5밀리리터를 입구 포트에 추가하고 칩을 분당 4, 000 회전으로 3분 동안 회전합니다. 회전의 끝에서, 칩이 분당 500 에서 1, 000 회전에서 회전하는 동안 준비 된 셀 서스펜션의 100 마이크로 리터로 입구 포트에서 배지의 100 마이크로 리터를 교체합니다.
그런 다음 3분 당 3, 000 회전에서 칩을 회전시켜 각 마이크로웰의 세포를 원심력으로 트랩한 후 3일 동안 세포 배양 인큐베이터에 칩을 배치하고 매일 입증된 바와 같이 배지를 새로 고침한다. 동심 스페로이드 공동 배양의 생성을 위해, 칩이 분당 500 ~ 1, 000 회전에서 회전하는 동안 칩의 입구 포트에 매체의 100 마이크로 리터에 세포의 첫 번째 인구를 추가하고 분당 3, 000 회전에서 3 분 회전. 회전의 끝에서 칩이 분당 500 ~ 1, 000 회전에서 회전하는 동안 두 번째 셀 집단의 100 마이크로 리터를 추가하고 칩을 분당 3, 000 회전에서 3 분 동안 회전합니다.
두 양의 세포가 모두 주입되었을 때 칩을 세포 배양 인큐베이터에 1, 000 에서 2, 000 회전을 24 시간 동안 분당 회전하십시오. 야누스 스페로이드 형성의 경우 칩이 분당 500에서 1, 000 회전에서 회전하는 동안 세포의 첫 번째 집단의 100 마이크로리터를 추가하고 분당 3분, 000 회전에서 3분 동안 회전합니다. 회전의 끝에서, 3 시간 동안 분당 1, 000 에서 2, 000 회전에 대한 세포 배양 인큐베이터에 칩을 배치합니다.
인큐베이션이 끝나면 칩이 분당 500에서 1, 000 회전에서 회전하는 동안 세포의 두 번째 집단의 100 마이크로리터를 넣고 3분 동안 분당 3, 000 회전에서 칩을 회전시합니다. 그런 다음 세포 배양 인큐베이터에 세포를 분당 1, 000 ~ 2, 000 회전에 24시간 동안 배치합니다. 샌드위치 스페로이드 형성의 경우 칩이 분당 500 ~ 1, 000 회전에서 회전하는 동안 첫 번째 세포 집단의 100 마이크로 리터를 먼저 추가하고 분당 3, 000 회전에서 3 분 회전합니다.
회전의 끝에서, 칩이 분당 500 에서 1, 000 회전에서 회전하는 동안 세포의 두 번째 집단의 100 마이크로 리터를 추가하기 전에 분당 1, 000 ~ 2, 000 회전에서 2 시간 동안 세포 배양 인큐베이터의 회전자에 칩을 배치합니다. 칩을 3, 000 RPM에서 3분간 회전하고 칩을 인큐베이터에 다시 넣고 회전시 3시간 배양을 합니다. 그런 다음 칩이 분당 500에서 1, 000 회전에서 회전하는 동안 첫 번째 세포 집단의 100 마이크로 리터를 추가하고 12 시간 동안 입증 된 대로 세포를 회전하고 배양합니다.
입증된 프로토콜에 따라 직경 6cmCMS 배양 칩을 성공적으로 제작할 수 있습니다. CMS 배양 칩의 채널은 입구 포트, 중앙, 슬라이드 및 마이크로웰 영역으로 구성됩니다. 개별 CMS 칩 내에서 배양의 처음 24 시간 동안 분당 2, 000 회전에서 찍은 두 가지 유형의 세포 배양의 시간 경과 이미지는 입증 된 바와 같이, 스페로이드의 성공적인 형성을 보여줍니다.
3 일간의 배양 후 마이크로웰의 이미징은 스페로이드가 우수한 균일성과 구형성을 보여 준다는 것을 보여줍니다. 코넨트리, 야누스 및 샌드위치 구조와 공동 배양 된 스페로이드도 생성 될 수 있습니다. 또한, 7일 동안 높은 중력에 노출된 세포 배양은 살아있는/죽은 염색에 이어 대부분의 세포가 칩 내에서 장기 배양에서 살아남는다는 것을 보여준다.
CMS 배양 칩의 상부 및 하부 층은 결합 될 때 신중하게 정렬되어야하며, 그렇지 않으면 각 마이크로웰의 세포 수는 동일하지 않을 수 있습니다. 이 연구는 공동 문화 스페로이드 연구를위한 진입 장벽을 낮출 수 있으며, 예를 들어, 관심의 새로운 약물을 선별하기 위한 공동 문화 연구에서 널리 사용될 수 있습니다.
