Essa técnica pode ser usada para gerar esferoides celulares de tipos individuais e múltiplos de células usando uma plataforma lab-on-a-CD, um sistema pioneiro para a rápida geração de esferoides. A técnica utiliza força centrífuga para depositar células em microwells designadas, permitindo a euforia sequencial de vários tipos de células para a produção de diversos esferoides. Para a fabricação de chips de cultura CMS, primeiro faça moldes de policarbonato para as camadas superior e inferior do chip de cultura por usinagem de controle numérico de computador.
Em seguida, misture a base PDMS e o agente de cura PDMS a uma proporção de 10 para um por cinco minutos antes de colocar a mistura em um desiccador por uma hora para remover bolhas de ar. Despeje a mistura PDMS desgaseada nos moldes de chip de cultura CMS e coloque os moldes no desiccator por mais uma hora para remover quaisquer bolhas de ar. No final do segundo desgaseamento, cure a mistura em uma câmara de calor a 80 graus Celsius por duas horas antes de colocar os chips em um aspirador de plasma aspirado com as superfícies a serem ligadas de frente para cima.
Exponha os chips de cultura ao plasma assistido pelo ar a uma potência de 18 watts por 30 segundos, e ligue as duas camadas do chip na câmara de calor a 80 graus Celsius por 30 minutos para aumentar a força de adesão. Em seguida, esterilize o chip de cultura CMS em uma autoclave a 121 graus Celsius por 15 minutos. Para preparar as células para a formação de esferoides, descongele um frasco de um mililitro contendo cinco a dez vezes 10 às cinco células de interesse em um banho de água de 36,5 graus Celsius por dois minutos antes de adicionar um mililitro de DMEM às células com mistura suave.
Em seguida, adicione as células a uma placa de Petri de 150 milímetros de diâmetro contendo 15 mililitros de 36,5 graus Celsius médio, e coloque o prato em uma incubadora de cultura celular por 24 horas. No dia seguinte, substitua o supernascedor por 15 mililitros de DMEM fresco, e devolva as células à incubadora. Para desprender as células, crie a cultura com quatro mililitros de trippsina por quatro minutos a 36,5 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, interrompendo a reação com meio fresco quando as células levantaram do fundo do prato.
Para rotular as células, aqueça um corante de fluorescência celular apropriada à temperatura ambiente antes de adicionar 20 microliters de sulfóxido de dimetil anidro ao frasco para obter uma solução mililitro. Diluir a fluorescência a uma concentração final de trabalho de um micromolar em DMEM, e adicionar o corante à suspensão celular de interesse com mistura suave. Em seguida, coloque as células na incubadora de cultura celular por 20 minutos.
Para a formação de esferoides monocultura, adicione primeiro 2,5 mililitros de solução F-127 plurônica de 4%plurônicos ao orifício de entrada do chip de cultura CMS enquanto gira o chip a 500 a 1.000 rotações por minuto. Quando toda a solução tiver sido adicionada, gire o chip a 4.000 rotações por minuto durante três minutos usando o sistema CMS. No final da rotação, incubar o chip de cultura durante a noite a 36,5 graus Celsius a 5% de dióxido de carbono.
Na manhã seguinte, remova a solução Pluronic e lave o chip de cultura com DMEM. Depois de secar o chip por 12 horas em um banco limpo, adicione 2,5 mililitros do meio à porta de entrada e gire o chip a 4.000 rotações por minuto durante três minutos. No final da rotação, substitua 100 microliters do meio na porta de entrada por 100 microliters da suspensão da célula preparada enquanto o chip gira em 500 a 1.000 rotações por minuto.
Em seguida, gire o chip a 3.000 rotações por minuto durante três minutos para prender as células em cada microwell por força centrífuga antes de colocar o chip na incubadora de cultura celular por três dias, refrescando o meio como demonstrado todos os dias. Para a geração de cocultura esferoide concêntrica, adicione a primeira população de células em 100 microliters de médio para a porta de entrada do chip enquanto o chip gira em 500 a 1.000 rotações por minuto seguido de três minutos de rotação a 3.000 rotações por minuto. No final da rotação, adicione 100 microlitadores da segunda população celular enquanto o chip gira em 500 a 1.000 rotações por minuto, e gire o chip a 3.000 rotações por minuto por mais três minutos.
Quando ambos os volumes de células tiverem sido injetados, coloque o chip na incubadora de cultura celular em 1.000 a 2.000 rotações por minuto durante 24 horas. Para a formação de esferoides Janus, adicione 100 microlitadores da primeira população de células enquanto o chip está girando a 500 a 1.000 rotações por minuto seguido de três minutos a 3.000 rotações por minuto. No final da rotação, coloque o chip na incubadora de cultura celular para rotação em 1.000 a 2.000 rotações por minuto durante três horas.
No final da incubação, adicione 100 microlitadores da segunda população de células, enquanto o chip gira em 500 a 1.000 rotações por minuto antes de girar o chip a 3.000 rotações por minuto durante três minutos. Em seguida, coloque as células na incubadora de cultura celular em 1.000 a 2.000 rotações por minuto durante 24 horas. Para a formação de sanduíches esferoides, primeiro adicione 100 microliters da população da primeira célula, enquanto o chip gira em 500 a 1.000 rotações por minuto seguido de três minutos de rotação a 3.000 rotações por minuto.
No final da rotação, coloque o chip em uma rotadora na incubadora de cultura celular por duas horas a 1.000 a 2.000 rotações por minuto antes de adicionar 100 microliters da segunda população de células enquanto o chip está girando em 500 a 1.000 rotações por minuto. Gire o chip a 3.000 RPM por três minutos, e coloque o chip de volta na incubadora para uma incubação de três horas com rotação. Em seguida, adicione mais 100 microliters da primeira população celular, enquanto o chip gira em 500 a 1.000 rotações por minuto, e gire e cultue as células como apenas demonstrado por 12 horas.
Seguindo o protocolo, como demonstrado, um chip de cultura CMS de seis centímetros de diâmetro pode ser fabricado com sucesso. O canal do chip de cultura CMS compreende um porto de entrada, e regiões centrais, deslizantes e microwell. Imagens de lapso de tempo de dois tipos de cultura celular tiradas a 2.000 rotações por minuto para as primeiras 24 horas de cultura dentro de chips CMS individuais, como demonstrado, mostram a formação bem sucedida de esferoides.
Imagens dos microwells após três dias de cultura mostram que os esferoides demonstram uma excelente uniformidade e esfericidade. Esferoides coculturados com estruturas conentricas, janus e sanduíches também podem ser gerados. Além disso, culturas celulares expostas à alta gravidade por sete dias, seguidas por coloração viva/morta, demonstram que a maioria das células sobrevive à cultura de longo prazo dentro dos chips.
As camadas superior e inferior do chip de cultura CMS devem ser cuidadosamente alinhadas quando estiverem ligadas, caso contrário, o número de células em cada microwell pode não ser igual. Este estudo pode diminuir a barreira de entrada para a pesquisa de esferoides de cocultura e pode ser amplamente utilizado em estudos de cocultura, por exemplo, para triagem de novos medicamentos de interesse.
