このプロトコルは、2つのタンパク質を発現する免疫療法用アカゲスT細胞の生産を概説する:抗ウイルスキメラ抗原受容体と、細胞をリンパ球卵胞に標的とするケモカイン受容体CXCR5。この比較的急速な9日間の手順は、動物への注入後に長期的に持続する可能性を持つ、より分化されていない中央記憶表現型を有するT細胞を産生する。この方法をヒト細胞に適応させることで、抗レトロウイルス薬の投与なしにHIVに対する耐久性のある寛解を誘導する可能性のある免疫療法T細胞の産生が可能になる。
この方法は、関心のある他のタンパク質を発現するアカゲスT細胞を産生するために広く使用することができる。また、軽微な改変により、ヒトを含む他の種でトランスデューセT細胞を生成するために使用することができる。伝達の成功は健康な刺激されたPBMCに依存する。
収集、輸送、および保管には注意が必要です。細胞の刺激を視覚的に評価することは、伝達の前に重要です。プライマリアテウスPBMCを解凍して開始します。
少量の氷が残るまで、穏やかな攪拌で37°Cの水浴で細胞をインキュベートします。細胞をコニカルチューブにそっとピペットします。その後、塩基性培地の1ミリリットルでバイアルをすすい、ゆっくりと細胞に加えます。
ゆっくりと細胞に暖かい基本的な媒体の追加9ミリリットルを追加.チューブをエアロゾル耐性キャニスターに入れ、600倍gで摂氏22度で5分間遠心分離します。上清を吸引し、少量の成長培地でペレットを再懸濁する。
細胞を数えるために、10マイクロリットルのトリパンブルーに細胞10マイクロリットルを加える。チャンバースライドをロードし、カウンターに挿入します。キャプチャ ボタンを押してセルをカウントします。
細胞濃度を体積で乗算して細胞の総数を計算し、増殖培地中の1ミリリットル当たり200万個の細胞に希釈する。ミリリットル当たり5マイクログラムの最終濃度に対して、抗CD28を加えます。その後、抗CD3コーティングされたプレートに井戸あたり3〜600万個の細胞をピペット。
プレートを摂氏37度と炭酸ガス5%で2日間インキュベートします。遠心分離機を2,000 gで約30分間走して摂氏32度に温めます。一方、37°Cの水浴で無血清と成長培地の両方を暖め、摂氏37度の水浴で穏やかに渦巻いてウイルスを解凍します。
その後、氷の上に置きます。ウイルスを無血清培地で所定の最適な感染倍数に希釈する。陰性対照細胞用の培地単独を用いて、フィブロネクチンコーティングプレートの各ウェルに希釈レトロウイルスの2ミリリットルを加える。
プレートをマイクロプレートキャリアの前温め遠心分離機に入れ、2時間2,000倍gで遠心分離します。すぐに使用する場合は、ウェルからウイルス製剤を吸引し、2ミリリットルの成長培地を添加する。反転顕微鏡で刺激されたPBMCsを確認します。
セルは丸く、明るく、光を屈折させる必要があります。彼らはまた、刺激を示す凝集した外観を持っている必要があります。標的細胞を収集し、50ミリリットルの円錐管に移します。
成長培地の1ミリリットルで一度よく各井戸をすすい、チューブにそれを追加します。次に、前に示したようにセルをカウントします。細胞を摂氏32度で5分間600倍gで遠心してペレット状にする。
ペレットから培地を吸引し、1ミリリットル当たり150万細胞の濃度で増殖培地中の細胞を再懸濁する。各ウイルスコーティングウェルに細胞懸濁液の1ミリリットルを追加し、ウイルスを受け取らなかったフィブロネクチンコーティングされたウェルにMACトランスデュース細胞を追加します。プレートを摂氏32度で10分間1,000倍にして、摂氏37度、炭酸ガス5%で48時間インキュベートします。
アカゲサス細胞やガンマレトロウイルスの使用には、ラボコートや手袋などの個人用保護具を使用する必要があり、バイオセーフティキャビネットで作業を行う必要があります。すべてのピペットと溶液は除染する必要があります。5ミリリットルのピペットを使用して各ウェルの内容物を上下にピペットし、細胞を再中断し、50ミリリットルの円錐管に移します。
各ウェルに成長培地の1ミリリットルを追加し、接着細胞を除去するために上下にピペット.次に、前述のようにセルをカウントします。25°Cで10分間600倍gで細胞を遠心分離します。
その後、培地を吸引し、1ミリリットル当たり100万細胞の濃度に膨張培地中の細胞を再懸濁する。6ウェルプレートの各ガス透過ウェルに5ミリリットルの細胞を播種し、井戸ごとにさらに25ミリリットルの膨張培地を慎重に重ねます。その後、摂氏37度と5%の二酸化炭素で4日間、邪魔されずに細胞をインキュベートします。
ウェルから細胞を収集するには、細胞を乱さないで注意して、メディアの20ミリリットルを除去し、廃棄します。残りの培地を上下にピペットして細胞を取り除く。滅菌移動ピペットを使用して、3ミリリットルの培地で各ウェルをすすい、残留細胞を収集します。
次に、それらを数え、セル番号と生存率を確認します。このプロトコルは、6つの異なる動物からの細胞の導入および拡張に使用された。ガス透過性ウェルを500万個の細胞の開始密度で播種し、4日間の成長の後、ウェル当たり5,560万個の細胞の中央値密度が達成された。
trypanブルー排除によって監視される細胞の生存率は、プロトコル全体で83〜95%に維持された。フローサイトメトリーを使用して、導入された遺伝子の共発現を観察した。5日目には、細胞の中央値42.8%がCD4-MBL CARおよびCXCR5の両方で導入された。
9日目の間、中央値の表現は47.6%で、単一の伝達ラウンドでした。フローサイトメトリーは、メモリ表現型のモニタリングにも使用された。導入と拡張の前に、ナイーブな中央記憶とエフェクターメモリ集団が同定された。
ナイーブ集団は培養で失われ、細胞は主に5日目と9日目までに中央記憶細胞であった。このトランスダクションの成功は、高品質の試薬、高生存細胞、および滴定ウイルスの使用に依存し、プロトコルのタイミングに一貫して従う。細胞は、移動およびウイルス抑制アッセイを含む機能アッセイに使用できるだけでなく、免疫療法の有効性をテストするための前臨床試験のための動物への注入のために使用することができる。
私たちは、動物のCARおよびCXCR5 T細胞の前臨床試験を進めており、すぐにHIV感染者でこの免疫療法をテストしたいと考えています。
