著者らは、アドバイスのためにここで説明する手法の開発へとアランコクランへの貢献のためにラボの過去と現在のメンバーに感謝します。 LAは、フレイザー、モナトとマクファーソンキャリア賞でサポートされている保健研究（CIHR）博士フェローシップとAJMのカナダの協会の者です。この作品は、CIHR（助成金＃MOP-56974）からの助成金によってサポートされています。

1。プローブ調製<ol><li>ダイジェスト1時間37℃でのin vitro転写ベクター、PKS（+）POL Kpn1酵素と236nt 9μgの、アガロースゲル上で線状化DNAの製品を実行します。断片は、約2500 bpのでなければなりません。 </li><li>ゲルの断片を切り取り、ロシュ社のマイクロ溶出ゲル抽出キット（使用されるすべての試薬 ​​は、表1に記載されています）を使用して精製する。 30μlの溶出バッファーの最後の溶出を実行します。精製を確認するためにアガロースゲル上で製品の5μlを実行します。 </li><li> 2時間37℃ロシュDIG RNAラベリングキットとインキュベートを用いたin vitro転写反応（下記レシピ参照） に混ぜる。 </li></ol> in vitro転写反応で ： <table border="1"><tbody><tr><td>直鎖状DNA </td><td> 23μlの</td></tr><tr><td> 1X DIG RNAラベリングミックス（ロシュ） </td><td> 4μlの</td></tr><tr><td> 1Xテリグマンnscriptionバッファ</td><td> 8μlの</td></tr><tr><td> 20UのRNase OUT </td><td> 1μlの</td></tr><tr><td> 80U T7 RNAポリメラーゼ</td><td> 4μlの</td></tr><tr><td>合計</td><td> 40μlの</td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> 15分間37℃でのDNase Iとインキュベート228 Uを追加します。 </li><li> 20mMの最終濃度にEDTA pHが8.0を加えることによって反応を停止します。 </li><li>メーカーによって指定されたロシュからクイックスピンカラムを用いて反応を浄化する。 </li><li> 1/10量のDEPC処理3M NaOAc pHが5.2と氷冷95％エタノールを2.5倍量で沈殿させることにより、プローブを精製します。混合し、一晩に30分間-80℃でインキュベートする。 </li><li> 15000×gで4℃15分°Cのためのプローブを遠心分離します。 </li><li>上清を除去し、氷冷70％エタノールでペレットを洗浄する。 15000×gで4℃5分°Cのために再度遠心します。 </li><li>上清を除去し、ペレットを乾燥させます。 50μlのwにペレットを再懸濁し10 UインビトロジェンRNaseを含むOUTアテル（デオキシリボヌクレアーゼ/ RNaseフリー）。 </li><li>吸光光度法によるプローブの濃度（260 nmで測定RNA）を推定し、ng /μLの5の濃度に希釈する。 -20℃でアリコートで店短期使用、または-80℃で長期保存のために。これは、インターアッセイの比較を行うので、このためのアリコートを節約することをお勧めします。 </li></ol> 2。細胞固定<ol><li>収穫時に最終的にコンフルエントには約70〜80％ですので、それは、未処理、滅菌したカバーガラス上にシード付着細胞に最初に重要である。非接着細胞の場合は、通常どおりに成長したときに収集する準備ができて、1時間に0.01％（w / v）のポリ-L-リジン（シグマアルドリッチ社製）で処理したカバースリップでそれらをインキュベートする。典型的な12ウェルのポリスチレン組織培養プレート（3.8 cm 2）のために、150,000細胞（例えば、HeLa細胞）をトランスフェクション前に24時間でメッキされています。非接着細胞は、感染またはトランスフェクトいつものようにと広告を許可することができますここで固定3の前にガラスカバースリップに。 </li><li>メディアを破棄し、1分間蒸留水（DPBS）で調製した1Xリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄する。ジエチル（DEPC、Sigma-Aldrich社、Inc。）を処理1X PBSは、しかし、未処理のPBSは、それがRNaseの酵素が含まれる場合がありますできないため、使用することができます。 </li><li> PBSを捨て、細胞を完全にカバーするのに十分な4％パラホルムアルデヒドを追加します。 15から20分間インキュベートします。 </li><li> paraformaldeyhydeを破棄し、1分間1X DPBSで細胞を洗浄する。 </li><li> DPBSを捨てて、0.1 Mグリシン（1X DPBSに溶解）を追加します。 10分間インキュベートする。 </li><li>グリシンを破棄し、1分間1X DPBSで細胞を洗浄する。 </li><li> DPBSを破棄し、トリトン-X（1X DPBSに溶解した）0.2％を追加します。 5〜10分間インキュベートします。核小体や核膜タンパク質を染色する場合は5分以上またはタンパク質の局在化のためにトリトンX-100は、拡散になると、透過性。 </li><li>トリトンX-100を破棄し、一度に洗う1分間1X DPBS。 </li><li>長期保存のために、最大4ヶ月までは4℃で70％エタノールストアでPBSを交換してください。また、1X DPBSで複数回洗浄し、FISHに進みます。 </li></ol> 3。 蛍光 in situハイブリダイゼーション （FISH） <ol><li>カバーガラスをエタノールに格納されている場合は、1X DPBSでエタノールを交換し、細胞が30分間再水和することができます。カバーグラスを4℃で保存されている場合は水分補給を一晩行うことができます</li><li> 1分間1X DPBSでカバーガラスを洗浄する。 </li><li>きれいにし、それらをよくラベルに注意しながら上にカバースリップをインキュベートするためにスライドを準備します。 </li><li> 18ミリメートルカバースリップ、スライドにDNase溶液（市販の25単位/カバースリップ）、50μlを加える。それはセル側を下に置き、室温で15分間静置している、カバースリップを追加します。 </li><li> 1分間1X DPBSでカバーガラスを洗浄する。 </li><li>カバースリップあたり50μlのハイブリダイゼーション混合物（以下のレシピを参照してください）​​に追加スライドと42℃16〜18時間のためにカバーガラスの細胞面を下にインキュベート℃にインキュベーションは、50％ホルムアミド、2×SSPEミックス（12.5ミリリットルの脱イオンホルムアミド、2.5ミリリットル20X SSPE、10 mlの水）を含むトレイで実行する必要があります。 </li></ol>ハイブリダイゼーションミックス（1カバースリップのために、50μL）： <table border="1"><tbody><tr><td> 在庫量 </td><td> 材料（最終濃度） </td></tr><tr><td> 25μlの</td><td>ホルムアミド、50％（イオン、任意のソース） </td></tr><tr><td> 5μlの（10 mg / mlの） </td><td> tRNAは、1 mg / mlの（シグマアルドリッチ社） </td></tr><tr><td> 5μlの（20Xの） </td><td> SSPE、2X </td></tr><tr><td> 5μlの（50Xの） </td><td> Denharts、5X </td></tr><tr><td> 0.125μL（5ユニットの） </td><td> RNaseのOUT </td></tr><tr><td> 5μlの（5、25 ngのng /μlに） </td><td>プローブ</td></tr><tr><td> 5μlの</td><td>最終的なをするH 2 O DEPC、ボリュームを50μl </td></tr></tbody></table><ol start="7"><li> 42℃15分間50μlの50％ホルムアミド（1X DPBSで希釈した）℃でインキュベートカバーガラスの細胞面を下</li><li> 5分ごとに42℃で50μlの2X SSPE（20X SSPEは1X DPBSで希釈した）にそれらの細胞側を下にインキュベートすることにより、2X SSPEで二度カバーガラスを洗う</li><li> 1分間1X DPBSにカバースリップを洗ってください。 </li></ol> 4。免疫蛍光染色<ol><li> 30分間、50μlの1Xロシュブロッキング溶液（1×DPBSで希釈した10Xのロシュ社のブロッキング溶液）にそれらの細胞側を下に置くことによって、カバースリップをブロックします。 </li><li> 37℃で1時間50μlの一次抗体溶液にカバーガラスの細胞面を下にインキュベートします。抗DIG抗体は1Xブロッキング溶液中で、製造元の指示に従って希釈する必要があります。他の抗体は、タンパク質を染色するために使用されている場合は、それらが使用されるすべての抗体は、異なるホスト仕様から導出されていれば正しい濃度で添加してもよいIES。 </li><li> 1X DPBSで10分間カバースリップを洗ってください。 </li><li> 37℃で1時間50μlの二次抗体溶液にカバーガラスの細胞面を下にインキュベートします。のAlexa Fluor®標識抗体（Invitrogen）を色の範囲を生成するために使用することができ、1Xブロッキング溶液、1X DPBSで1:500で使用されます。 </li><li> 1X DPBSで10分ごとに倍カバースリップを洗ってください。 </li><li>ワットマン紙の上にカバーガラスの細胞面を上にして乾かします。光と漂白への曝露を避けるために、カバースリップをカバーするようにしてください。 </li><li>すべての液体が蒸発した後、8μlのImmunoMount（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用して、新鮮なスライドにカバースリップをマウントします。静かに気泡を除去するためにカバースリップをタップします。 </li><li>所定の位置に固定するためにカバースリップの端をマニキュア適用されます。 </li><li>顕微鏡技術によるRNAおよびタンパク質の可視化も、この技術の成功に不可欠です。それが鍵となりますので、使用する顕微鏡の設定は、視覚化を助けたり、妨げることができます顕微鏡の設定は正しく設定され、指定された実験では1つのサンプルから別の一貫性を保つことができます。詳細顕微鏡の設定については、光学系と抗体の組み合わせは、参照の1,10を参照してください。 </li></ol> 5。代表的な結果ウイルスRNA染色の例を図2に見ることができます。小細胞punctaeは珍しいものではありませんが、HIV-1ウイルスRNAは、大部分はびまん性に表示された細胞質全体に見られている。特異性は全く蛍光を表示しない周囲の細胞に陽性細胞を比較することによって見ることができます。これは核の明るいシグナルとして可視化することができ、細胞質内RNAの蛍光信号の不足などの導入で述べたように、規制のRevタンパク質を欠いているHIV-1は核内に保持されるRNAを生成します。細胞タンパク質の過剰発現はまた、HIV-1ウイルスRNAの分布をシフトさせることができます。 図2の</強い&gt;、エンドソーム小胞輸送に関与するタンパク質の過剰発現（例えば、RAB7相互作用するリソソーム蛋白質（RILP）11またはN-末端削除RILP（RILPN）11と、ダイニン運動機能を妨げるタンパク質は、[例えばp50/dynamitin 1、 12]は 、FISH分析により決定されたウイルスゲノムRNAの正常な定常状態の局在を妨げるRILP発現は微小管組織の中心（MTOC）13〜ウイルスゲノムRNAの再局在化につながる; RILPN後半分散内のエンドソームダイニンモーター複雑な14 p50/dynamitinブロックダイニンモーターとリリースの大サブユニットの集成 P150にバインドできないために、細胞質は、後期エンドソームでなく、細胞周囲にウイルスゲノムRNAとHIV-1構造タンパク質1（ 図2）ウイルスゲノムRNAの感染性に重要な貢献者の定常状態の局在化の操作は、ウイルス粒子は、治療薬の最終的な開発の鍵となります。我々の手では、ウイルスRNAは、早ければ3時間後にトランスフェクションと感染10などのセルに表示され、12時間することによって、このFISH法により容易に観察可能になります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" /> 図1。 FISH / IFの共同分析のためのプロトコルのフローチャートである。細胞はカバースリップの上に成長し、パラホルムアルデヒドで固定されています。細胞はどちらFISH / IF用に使用したり、ストレージの70％エタノールに格納される前にグリシンおよびTriton-Xの治療が行われます。ストレージ用の脱水細胞はFISH / IFに進む前に1X DPBS（DEPC処理PBS）で再水和されています。細胞はDNase Iで処理し、プローブとハイブリダイズするために一晩放置されています。一度ハイブリダイゼーションが完了すると、細胞は同様にSSPEと同じように、ホルムアミドで洗浄し、最後の1X DPBSリンスされています。ブロッキング液とのインキュベーションに続いて、セルに適用され一次抗体。洗浄後、二次抗体が適用されます。 1X DPBS二最後の洗浄では、イメージングのためのカバースリップ上に乾燥させ、スライド上にマウントされた染色の手順を実行します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" /> 図2。 FISH / IF共同分析を用いて代表的な結果。）HIV-1は、細胞タンパク質の過剰発現（RILP、p50/DynamitinとRILPΔN（アミノ末端欠失変異体））を引き起こすコンストラクトでHeLa細胞に、いくつかのケースでトランスフェクトされる。 FISH / IF共同分析を行った：RNAを区別するためにG3BPまたはLAMP1（赤）のいずれかで緑色で識別されます。 B）HIV-1はHeLa細胞で発現させ、異なる時点で収集されます。細胞タンパク質のhnRNP A1は、赤色に染色されている間、ウイルスRNAの発現は、緑色で追跡されます。サイズバーは10μmである。画像は、文献1（; RILP、p50/Dynamitin、とRILPでるパネルから選択して数字）から変更、17（パネルB）。

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利害の衝突が宣言されません。

FISH / IFの共同分析では、現在9,15,16洗練された細胞内でウイルスRNAを可視化する信頼性の高い方法です。数年にわたって、我々はRNAを染色の洗練された方法を開発した。この手法は、プローブが標的RNA 17に固有のもので設けられたセルの種類の幅広い使用することができます。 DIGプローブを標識することによって、我々は単純な染色によるRNAを可視化することが可能である。 RNAと他のタンパク質を染色するが結合されたときに、FISH / IF共同分析は、細胞の構造と蛋白質/ RNAの局在を観察するための強力なツールになります。 RNA検出の特異性はかなり高いです。これは図2に示されています。ウイルスゲノムRNAの局在化に焦点を当てたオリジナル作品の一部で、FISHは、Revの欠如が核18でウイルスRNAをトラップことを確立した。これ以来、ウイルスゲノムRNAの局在化に関する豊富な新しい情報がtechniquを使用して得られたeは、ここで概説した。過剰発現細胞のタンパク質によって、特定の集団としないウイルスRNAすべてのセルの異なる領域にローカライズするために強制することができます。のhnRNP A2がでsiRNAによって枯渇した場合に得られる表現型HIV-1発現細胞を13に似ているRILPの過剰発現は、RNAが目に見えてMTOCに蓄積させる。 （携帯周囲に細胞内ドメインからのウイルスゲノムRNAのリリースでは、ダイニン重鎖1の結果のp50/Dynamitin過剰発現やノックダウン：ウイルスゲノムRNAはマイナス端モータータンパク質、ダイニンを無効にすることにより、細胞周囲にプッシュすることができます図2）。彼らはもはや積極的にjuxtanuclearドメインに局在しているため、もはやダイニンモーターをバインドされることはありませんRILP、RILPΔNの変異体は、分散するには、細胞質に（LAMP1でタグ付けされた）エンドソーム。これらの結果は、HIV-1ゲノムRNAの、特にプラスチック製の人口の概念を指すようHIV-1ゲノムの異なるプールウイルス複製サイクルの中で時々識別可能な役割と存在するRNA。これらの同じ概念は、すでにこのmRNAによってコードされるタンパク質、ギャグ19の同定されている。 抗体の選択性と可用性に関連するFISH / IFの共同分析の用途に制限があります。一次および二次抗体の最適な組み合わせの最適化、およびそれらの濃度は、（ 表1＆2を参照） を最適化するために時間がかかります。大手企業によるハイブリドーマから作られた、または産生された抗体は、1:2から1:2000にどこでも異なる濃度を持っていますが、最良の結果を得るために製造元から提供されているガイドラインに従ってくださいすることができます。抗体が生成されているホストも考慮の下で撮影する必要があります。ヤギ抗体との混合の羊はまた、クロス種認識（データは示さず）に起因する高いバックグラウンドでこの組み合わせの結果として、一次および二次抗体は避けるべきである。アレクサ·弗素seconda用RY抗体は、濃度は、セットのほぼすべての抗体を1:500で使用することができます。このレポートで説明したようにFISH /共同分析IFへの他の欠点は、細胞を固定し、パラホルムアルデヒドと洗剤（ 図1）を使用して透過された後、それが定常状態でその位置でRNAを捕捉します。 しかし、生細胞内RNAイメージングは、主にGFPなどの蛍光タンパク質でタグ付けされたウイルスRNAゲノムのバリエーションを使用して、手段20から22までのさまざまなを実現しました。しかし、生細胞中のRNAの局在を同定するための追加手段が表面に進みます。これらの新しいメソッドは、ほうれん草23、SNAP 24の手段、またはMTRIP 2タギングRNAを含んでいます。これらの技術はまた部分が顕微鏡でmRNAを検出するためにmRNAをタグ付けするように設計されなければならないこと基板を追加したりする前に、細胞を透過処理するための要件を含むいくつかの欠点がある。確かに、主要なアドバこのレポートで概説したFISH解析のntageは、ネイティブのRNAが最も生理学的に関連性の高い結果につながる不変であるという事実にある。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 18ミリメートルカバースリップ</td><td> VWR </td><td> 48380 046 </td><td></td></tr><tr><td> 16％パラホルムアルデヒド</td><td> JTベーカー</td><td> S898-07 </td><td>百分の四を作るために：5滴NaOHで60°Cで500mLに1XDPBSで20グラムを溶かす。 -20℃で、熱や店舗から7.2へのpH 70を超えないようにしてください°C！ </td></tr><tr><td>トリトン-X </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロ溶出ゲル抽出キット</td><td>ロシュ社</td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNAラベリングミックス</td><td>ロシュ社</td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td>転写T7 RNAポリメラーゼ</td><td>インビトロジェン</td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td>クイックスピンカラム</td><td>ロシュ社</td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> DNアーゼI </td><td>インビトロジェン</td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> 1XのDPBS </td><td>ギブコ</td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> tRNAの</td><td>インビトロジェン</td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> RNaseのOUT </td><td>インビトロジェン</td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td>蛍光抗体エンハンサーは、DIG検出のための＃4（ブロッキング溶液）を設定します。 </td><td>ロシュ社</td><td> 1768506 </td><td></td></tr><tr><td>のAlexa Fluor®二次抗体</td><td>インビトロジェン</td><td>表2を参照してください。 </td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン</td><td> Boekel科学他の同種</td><td>モデル24100 </td><td></td></tr><tr><td> Microslides </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9990402 </td><td></td></tr></tbody></table> 表1特異的試薬および機器の識別<table border="1"><tbody><tr><td> 抗DIG抗体の種（希釈;会社、カタログ番号） </td><td> 色 </td><td> のAlexa Fluor使用（1:500） </td></tr><tr><td rowspan="3">マウス（1:500、Sigma社、B7405） </td><td>緑</td><td>のAlexa Fluor 488ロバ抗マウス（Invitrogen社、A21202） </td></tr><tr><td>赤</td><td> Alexa Fluor 594のロバ抗マウス（Invitrogen社、A21203） </td></tr><tr><td>青</td><td>のAlexa Fluor 647ロバ抗マウス（Invitrogen社、A31571） </td></tr><tr><td rowspan="3">羊（1:200;ロシュ、11376623） </td><td>緑</td><td>のAlexa Fluor 488ロバ抗ヒツジ（Invitrogen社、A11015） </td></tr><tr><td>赤</td><td> Alexa Fluor 594のロバ抗ヒツジ（Invitrogen社、A11016） </td></tr><tr><td>青</td><td>のAlexa Fluor 647ロバ抗ヒツジ（Invitrogen社、A21448） </td></tr></tbody></table> 表2のカタログ番号と濃度で記載されている二次抗体と抗DIGの組み合わせ。

detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)

細胞はウイルス複製のためのエネルギーや資源を流用するのに役立つ正常な細胞機能に固有の変更を誘発感染するウイルス。宿主細胞の機能の多くの側面は、通常、募集宿主細胞タンパク質と機械そのウイルスの遺伝子産物の発現により、ウイルスによって徴用されています。また、de novoの感染時にセルの領域（ターゲットとするモバイル小胞とモータータンパク質の上でウイルスエンジニア特定の膜小器官またはタグを、ウイルス共同OPT分子モータータンパク質は、核を対象とする。以降では、ウイルスの組み立て時に、彼らは携帯電話ハイジャックされウイルスの組み立てに役立ちます機械）。以下は、ウイルスは、特にRNAゲノムを持つものは、タンパク質とRNAの両方のコンポーネントの細胞内輸送を調整し、それらが細胞内の特定の遺伝子座での感染性粒子のアセンブリを達成する方法をどのように理解されています。 RNAの局在化の研究は、以前の仕事に始まりました。 EMは、下等真核生物の開発bryosと神経細胞は、生物学的に重要な情報を提供し、また、遺伝子発現カスケードのプログラミングでRNAの局在化の重要性を強調した。他の生物と細胞システムの研究では、同様の重要な情報が得られている。ウイルスは絶対寄生虫であり、複製するためにそれらの宿主細胞を利用する必要があります。したがって、RNAウイルスが子孫ウイルス粒子1に、核から、核膜孔を介して、細胞質を通って最終的な宛先のいずれかに彼らのRNAゲノムを指示する方法を理解することが重要です。 FISHは、ウイルスRNAの定常状態の局在の変化を識別するために有用なツールとして機能します。免疫蛍光法（IF）の解析22と組み合わせると、FISH / IFの共同分析では、ウイルスRNAの3タンパク質の共局在についての情報を提供します。この分析は、したがって、他の生化学的または生物物理学によってRNA-タンパク質相互作用をテストするための良い出発点を提供しています単独での共局在から4,5のテストでは、相互作用の特定であるための十分な証拠はありません。このような方法を用いてウイルスRNAの局在化の研究に、豊富な情報は、ウイルスと細胞のRNAの人身売買のイベント6の両方で得られている。例えば、HIV-1感染細胞の核内でRNAを生成しますが、RNAは、細胞質に翻訳されています。つのキーウイルスタンパク質が欠落している（改訂）7、ウイルスRNAのFISHは、ウイルス複製のブロックが核8 HIV-1ゲノムRNAの保持によるものであることを明らかにした。 ここでは、 その場でウイルスゲノムRNAの視覚的な分析手法を提案する。方法は、標識したRNAプローブを使用しています。このプローブは、ウイルスのゲノムRNAと相補的になるように設計されています。アンチセンスRNAプローブのin vitro合成中に、ジゴキシゲニン（DIG）で修飾されているリボヌクレオチドは 、in vitro で transcrに含まれていますiption反応。プローブは、細胞内の標的mRNAにハイブリダイズした後にFISH / IFを実行するときに、その後の抗体標識のステップ（ 図1）は、mRNAの局在だけでなく、目的のタンパク質を明らかにする。

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Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

蛍光<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）法は視覚的に蛍光顕微鏡を用いてウイルスゲノムRNAを検出するために開発されました。プローブをハイブリダイゼーションと免疫蛍光技術の組み合わせを用いて同定することができるウイルスRNAに特異性で作られています。この手法は、細胞内のウイルスの人身売買のイベントの制御に関する情報を提供し、定常状態でウイルスRNAまたはDNAの局在を同定するという利点があります。

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

detection-of-viral-rna-by-fluorescence-in-situ-hybridization-fish

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

38.4K ビュー.  Sir Mortimer B. Davis Jewish General Hospital. 蛍光その場でハイブリダイゼーション（FISH）法は視覚的に蛍光顕微鏡を用いてウイルスゲノムRNAを検出するために開発されました。プローブをハイブリダイゼーションと免疫蛍光技術の組み合わせを用いて同定することができるウイルスRNAに特異性で作られています。この手法は、細胞内のウイルスの人身売買のイベントの制御に関する情報?...

ビデオ: Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

蛍光その場で</emヒト精子の>ハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

生物学

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

HeLa細胞のトランスフェクションに続いてGaussiaルシフェラーゼmRNA のインビトロ転写とキャッピングの

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析<em&gt; in situで</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNAを<em&gt;その場</emホールマウント胚および細胞組織学で&gt;ハイブリダイゼーションは、海洋軟骨魚類に適合した

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

組み合わせたDNA-RNA蛍光<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）差別雌マウス胚性幹細胞におけるX染色体の不活性化を研究するために、

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell level to detect the spatial dynamics of RNA localization with simultaneous insight into the localization of proteins, epigenetic modifications and other details which can be highlighted by immunofluorescence. X-chromosome inactivation is a paradigm for long non-coding RNA (lncRNA)-mediated gene silencing. X-inactive specific transcript (Xist) lncRNA accumulation (called an Xist cloud) on one of the two X-chromosomes in mammalian females is a critical step to initiate X-chromosome inactivation. Xist RNA directly or indirectly interacts with various chromatin-modifying enzymes and introduces distinct epigenetic landscapes to the inactive X-chromosome (Xi). One known epigenetic hallmark of the Xi is the Histone H3 trimethyl-lysine 27 (H3K27me3) modification. Here, we describe a simple and quick immuno-FISH protocol for detecting Xist RNA using RNA FISH with multiple oligonucleotide probes coupled with immunofluorescence of H3K27me3 to examine the localization of Xist RNA and associated epigenetic modifications. Using oligonucleotide probes results in a shorter incubation time and more sensitive detection of Xist RNA compared to in vitro transcribed RNA probes (riboprobes). This protocol provides a powerful tool for understanding the dynamics of lncRNAs and its associated epigenetic modification, chromatin structure, nuclear organization and transcriptional regulation.

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.

クイック蛍光<em&gt;その場で</emX染色体不活性化におけるヒストン修飾の免疫蛍光とのXist RNA複合のための&gt;ハイブリダイゼーションプロトコル

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

蛍光DNAための簡単​​な方法<em&gt;その場で</em&gt;ぺしゃんこ染色体へのハイブリダイゼーション

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

RNA結合タンパク質の検出によって、<em&gt;インビトロ</em脂肪細胞培養における&gt; RNAプルダウン

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...