腫瘍オルガノイドは、腫瘍生物学を研究するインビトロがんモデルとして広く使用されています。私たちのプロトコルは、がん生物学の様々な側面を研究するための重要なツールとして機能する膀胱腫瘍オルガノイドを単離、培養、および遺伝的に操作するための詳細な手順を提供します。私たちのプロトコルを使用して、膀胱腫瘍オルガノイドを遺伝的に操作して、私たちの関心のある遺伝子を発現またはノックアウトすることができます。
また、私たちの整形性移植法により、無傷の腫瘍微小環境腫瘍オルガノイドを作成することができます。この手順のデモンストレーションは、当研究室の大学院生であるキム・ユビンです。まず、マウス膀胱腫瘍から膀胱腫瘍オルガノイドを確立することから始めます。
DMEMに10ミリモルHEPESの1ミリリットルを腫瘍断片に加え、殺菌されたカミソリの刃で組織をミンチする。断片を細胞懸濁液に解約するには、HEPES、コラゲナーゼタイプ1と2、サーモリシンを含む9ミリリットルのDMEMを腫瘍片に加え、摂氏37度で1.5~2時間、軌道シェーカーに5%の二酸化炭素をインキュベートする。インキュベーション後、細胞懸濁液を50ミリリットルチューブに移します。
チューブを摂氏4度で5分間400倍にして、上清を吸引する。ペレットを5ミリリットルのACKライシングバッファーに再懸濁し、室温でチューブを3〜5分間インキュベートして赤血球を融解します。一方、150マイクロリットルの氷冷成長因子で24ウェルプレートにウェルをコーティングし、基質膜マトリックスを減少させ、プレートをインキュベーターに30分間置きます。
20ミリリットルのDMEMを細胞と一緒にチューブに加え、遠心分離を繰り返します。上清を吸引し、ペレットを0.25%トリプシンEDTAおよび10マイクロモルY-27632二塩酸塩の1ミリリットルで再懸濁する。37°Cの水浴で5分間チューブをインキュベートします。
その後、10%FBSでDMEMの10ミリリットルを加えることによってトリプシンを中和します。新しい50ミリリットルチューブ上の100マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液をろ過し、未消化の破片を除去します。チューブを摂氏4度で5分間400倍にして、上清を吸引する。
その後、ペレットをDMEMの1ミリリットルで再懸濁し、ヘミック計で細胞を数えます。4つの腫瘍細胞に3〜4倍の10を氷上の1.5ミリリットルマイクロチューブに移し、400倍gで摂氏4度で3分間遠心分離する。上清を慎重に除去し、500マイクロリットルのプリウォームオルガノイド培地および10マイクロモルY-27632で細胞を再懸濁します。
細胞懸濁液を以前に調製した膜マトリックスによくコーティングし、24ウェルプレートをインキュベーターに戻します。2日ごとに培地を500マイクロリットルのプリウォームオルガノイド培地に交換してください。レンチウイルス媒介伝達の12時間前に腫瘍オルガノイドを分割する。
翌日、37°Cの水浴でアリコートを含むウイルスを素早く解凍する。解凍したウイルスを10マイクロモルY-27632、ヘキサジメトリン臭化物1ミリリットルあたり8マイクログラムのオルガノイド培地250マイクロリットルに加えます。24ウェルプレートのオルガノイド培地を培地を含むウイルスの500マイクロリットルに置き換え、摂氏37度と5%の二酸化炭素で12〜16時間プレートをインキュベートします。
膀胱腫瘍オルガノイドを整形性移植のために準備するには、24ウェルプレートのオルガノイド培地に500マイクロリットルのコラゲナーゼディスパーゼを加える。基部膜マトリックスと媒体を上下にピペットし、37°Cでプレートを20分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を15ミリリットルのチューブに集め、5ミリリットルのプリウォームDMEMを加えます。
その後、チューブを摂氏4度で3分間400倍gで遠心し、上清を吸引する。ペレットをDMEMの1ミリリットルで再懸濁し、溶液を90ミリメートルのペトリ皿に移します。顕微鏡下で、P200ピペットで10〜100個の腫瘍オルガノイドを拾い、氷の上のマイクロチューブに集めます。
マイクロチューブを遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。次に、マウスが手術の準備ができるまで氷の上にペレットを維持します。粘膜下膀胱壁移植の前に、注射器、ピペットの先端、および基質膜マトリックスを氷の上に保管して、使用する準備が整います。
マウスを麻酔した後、仰向けの位置に置き、2%気化したイオブルランのマスク吸入によって麻酔を維持する。ポリビドーネを無菌ガーゼで塗布し、70%エタノールで拭き取ります。滅菌手術用はさみで下の正中腹部の皮膚と筋肉壁に小さな横切り切開を行います。
腹腔から膀胱を露出し、生理液浸し綿棒でそれをサポートします。50%高濃度基底膜マトリックスを含むオルガノイド培地の80マイクロリットルでオルガノイドペレットを再懸濁し、インスリン注射器を使用して膀胱ドームの前側面に懸濁液を注入する。4-0ナイロン縫合糸で切開を閉じ、ポビドンヨウ素と70%エタノールで手術部位を消毒します。
マウスを赤外線照射器の下で10~15分間回復させます。その後、意識が回復するまでマウスを再び監視します。マウス膀胱腫瘍オルガノイドを樹立し、9日間培養した。
腫瘍細胞が腫瘍オルガノイドを形成しない場合、解離工程中に殺される可能性があり、酵素消化時間を調整する必要があります。膀胱腫瘍オルガノイドは、レンチウイルス感染に成功した強力なGFPシグナルを示した。濃度の後、合計250マイクロリットルのウイルス含有培地は、基膜マトリックス上の30,000個の単一腫瘍細胞に感染し、90〜100%の感染効率を維持するのに十分であった。
膀胱腫瘍同種グラフは、異形移植の3週間後に採取し、H&E染色を用いて腫瘍の組織を分析した。腫瘍オルガノイドの異形移植は、膀胱腫瘍として2〜3週間成長する可能性があります。この手順に従って、研究者は、得られた腫瘍オルガノイドの免疫組織化学を行うか、または関心のある遺伝子に対して定量的RT-PCRを実施することができる。
これらの実験は、腫瘍オルガノイドをさらに特徴付けることができる。我々のプロトコルは、膀胱癌の腫瘍形成に関与する様々な遺伝子の特定の機能を研究するために腫瘍の生体内特性を維持しながら、マウスモデルと比較して癌細胞の遺伝子を容易に操作することを可能にする。
