精密医療ツールとしての膀胱癌オルガノイドの培養

患者由来のオルガノイドは、このマルチスペクトル疾患の遺伝的および表現型の不均一性を頻繁に模倣するため、泌尿器科癌を研究するための迅速かつ強力なツールを提供するため、この方法は重要である。オルガノイドは、限られた量の患者生検材料から単離することができ、下流分析のために迅速に拡張することができる。このプロトコルを使用して生成されたオルガノイドは、泌尿器科がんの細胞的および分子的基盤を理解するのに役立つモデルとして、また、がんがどの治療法および個々の患者に反応するかを予測するための精密医療ツールとして使用できます。

まず、手術から新鮮な巨視的に生存可能な腫瘍標本を収集し、輸送中にサンプルが滅菌50ミリリットルの円錐形チューブまたは尿検体ジャー内の輸送媒体に沈んでいることを確認する。組織重量、サンプルの説明、血液および尿サンプルに関する詳細を含む検体の詳細を患者検体処理シートに記録します。輸送媒体を10ミリリットルの基礎培地と慎重に交換し、腫瘍組織が重力によって沈降するのを許す。

次に、鉗子を用いて腫瘍組織を除去し、滅菌された90ミリメートルのペトリ皿に入れる。組織の重量をグラムまたはミリグラム単位で臨床検体処理シートおよび解剖グリッドに記録する。次いで、メスハンドルに取り付けられた使い捨てメスブレードに滅菌鉗子を用いて、非癌組織および巨視的に見える壊死領域を除去する。

腫瘍片を冷たいDPBSで1〜2回洗浄し、収集して新しい滅菌90ミリメートルのペトリ皿に移す。写真を撮り、組織図を描き、臨床処理グリッド上で組織解剖を計画する。病理組織学的分析のために、約50ミリグラムの腫瘍組織を標識された使い捨てプラスチック組織学カセットに入れる。

次いで、組織学カセットを10%中性緩衝ホルマリンの5倍〜10倍容量の容器に沈め、一晩インキュベートする。翌日、ホルマリンを70%エタノールと交換し、組織が処理できるようになるまで摂氏4度で保存する。分子分析のために、液体窒素を使用してRNase、DNase遊離の1.5ミリリットルのクライオビアル中の少なくとも1つの腫瘍片をスナップ凍結し、摂氏マイナス80度で保存する。

次に、残りの腫瘍片を含む90ミリメートルのペトリ皿に5ミリリットルのオルガノイド培地を分注し、組織を機械的にできるだけ細かく刻む。滅菌数10メス刃を用いた。細かく細かく刻んだ組織を50ミリリットルの円錐形のチューブに移し、細胞凝集を避けるために、4ミリリットルのオルガノイド培地、1ミリリットルのコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ1ミリリットルおよび0.1ミリグラムのDNaseIを加える。

ミンチした腫瘍組織を酵素溶液中でインキュベーター内のオービタルシェーカーまたはローテーター上で1〜2時間インキュベートし、断片を細胞懸濁液に解離させ、コラーゲンを分解する。次いで、試料に2倍の容量の基礎培地を加えて消化を止める。試料を遠心分離し、吸引し、上清を捨てる。

次に、汚染された赤血球を溶解するために、ペレットを5ミリリットルの塩化アンモニウムカリウム緩衝液に再懸濁し、室温で3分間または赤血球の完全な溶解が見られるまでチューブをインキュベートする。その後、20ミリリットルの基礎培地をチューブに加える。再度遠心分離し、上清を吸引する。

このステップでは、2倍および1倍のオルガノイド培地の10ミリリットルのアリコートを摂氏37度の水浴に入れて温めます。最初に、予め濡れた可逆的な100ミクロンのストレーナーを通してサンプルを新しい50ミリリットルのチューブにろ過し、大きな不溶性物質を除去します。次に、溶出液をプリウェット可逆的な37ミクロンストレーナーでろ過し、単一細胞を小さなクラスターに集めて単一細胞および免疫細胞を単離します。

次に、37ミクロンのストレーナーを反転させ、10ミリリットルの基礎培地を追加して、小型および中規模のクラスターを収集します。これらの新しい50ミリリットルチューブのそれぞれにDPBSを40ミリリットルまで補充し、懸濁液を遠心分離して上清を捨てます。次に、単一細胞を含むチューブに10ミリリットルの基礎培地を加え、自動セルカウンターでトリパンブルー排除色素を使用して細胞をカウントする。

細胞数と細胞の生存率を決定します。残りのサンプルを遠心分離し、培地を10%ウシ胎児血清1%ペニシリンおよびストレプトマイシンおよび10%DMSOを含む細胞凍結溶液または基礎培地と交換し、次いでサンプルを1.5ミリリットルのクライオビアに入れ、自己凍結容器に保管し、直ちに容器をマイナス80°Cの冷凍庫に移す。翌日、クライオバイアルを極低温液体または気相貯蔵に移し、長期保存する。

次に、収集した小型および中型のクラスターを、500マイクロリットルの予め加温された2倍オルガノイド培地で再懸濁する。次に、氷冷P-1000滅菌フィルターピペットチップで、BMEを細胞に加え、穏やかに混合する。再構成細胞BME混合物100マイクロリットルを超低付着のウェルに迅速かつ慎重にピペットし、平底96ウェルプレート、およびプレートをインキュベーターに入れて20〜30分間固化させた。

インキュベーション後、経験的に評価された体積に応じてBME細胞懸濁液の上にオルガノイド培地を1〜2の比率で加え、プレートをインキュベーター内に20分間置いて平衡化させた。インキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出し、顕微鏡のステージ上の試料ホルダーに組み立てて、位相コントラストまたは明視野設定下でオルガノイドを視覚的に評価します。50マイクロリットルの予め加温したオルガノイド培地を使用して2〜3日ごとに培地を補充し、枯渇した成長因子および総体積を補充する。

パスエージングの前に、1日目、2日目、3日目、5日目、7日目、10日目のタイムラプス系列画像を取得します。市販のコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼおよびDNase Iによる膀胱癌組織の2時間の消化は、膀胱の固有層および筋肉層内の新生物細胞を含む、より複雑な膀胱切除生検組織の0.5〜1立方ミリメートル片の十分な消化をもたらす。より大きな消化後断片は、新規な二次元培養物を単離するための任意のサイズの培養および標準的な組織培養プレートに適している。

この手順によって生成されたオルガノイドは、凝集、圧縮、およびタイトな細胞構造の最終形成の段階を含む動的自己集合を受ける。組織学的には、これらの構造は元の患者腫瘍を反復する。この手順で生成されたオルガノイドは、さらなる組織病理学的特徴付け、バイオバンキング、および薬物有効性試験を含む多くの目的に適している。

オルガノイドの生成に続いて、抗癌療法、代謝プロファイリング、または転写プロファイリングの役割を含む、これらの腫瘍をプロファイリングするために追加の方法が使用され得る。この3Dフレームワークの中で、これらの追加の方法論は、膀胱癌生物学への強力な洞察を提供します。この方法は、免疫腫瘍学および細胞代謝を調査する研究のための重要な基盤であった。