Bu protokol, canlı hücrelerde mitokondriyal membran potansiyeli ve mitokondriyal kitlenin ölçülmesine olanak sağlayan basit bir akış sitometrisi esaslı bir testtir. Standart metabolik tahliller hematopoetik kök hücreler gibi nadir popülasyonlarla çalışırken başarısız olur. Bu yöntem, düşük sayıda hücre ile çalışırken ve HSC'ler gibi hücrelerin yeni metabolik modülatörlerini belirlemek için kullanıcıların mitokondriyal membran profilleme sağlar.
Ayrıca, kemik iliği nakli veya koloni oluşturan tahliller gibi alt fonksiyonel tahliller ile hücrelerinizin işlevselliğini belirlemek için kültür sonrası birleştirebilirsiniz. Tekniğimiz, ablatif tedaviler sonrası kemik iliği nakli ve hematopoetik immün iyileşme bağlamında HSC işlevini geliştirebilecek yeni moleküllerin tanımlanması nda kullanılabilir. Protokolümüzde açıklandığı gibi, metodumuz immün T hücrelerinin metabolik uygunluğunu değerlendirmek için kullanılabilir.
Hücrelerin boyandıktan sonra ışığa en az maruz kalmaları çok önemlidir. Ayrıca pompa efflux'ün katkısını değerlendirmek için pompa inhibitörü verapamil kullanımının da dahil edilmesi gerekmektedir. Ancak, kullanıcılar verapamil derinden iyonik denge perturbs ve mitokondriyal membran potansiyeli üzerinde bir metabolik modülatör etkisini değerlendirmek için kullanılamaz farkında olmak zorunda.
Bu yöntemin görsel gösterimi son derece önemlidir, çünkü düşük sayıda hücreyle çalışırken akılda tutulması gereken bazı kritik adımlar vardır ve bu adımlar genellikle kullanıcıların PubMed'de okuduğu normal kağıtlarda eksiktir. FAC sıralama için, LKS popülasyon, soy negatif, Sca1 pozitif, cKit pozitif ile tanımlanır. LKS popülasyonundaki hücrelerin yaklaşık %5 ila %10'undan oluşan hematopoetik kök hücreler, HSC olarak etiketlenen CD150 pozitif, CD48 negatif popülasyonu için gating ile tanımlanır.
Hematopoetik kök hücre sıralamasından sonra tüpleri 300 kez g'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Peleti çıkarmadan süpernatantın çoğunu nazikçe çıkarın ve hücre peletinin üzerine 50 ila 80 mikrolitre bırakın. Kök hücre genişletme ortamındaki hücre peletini 200 mikrolitrelik son bir hacme kadar yeniden askıya alın.
96 U-alt kuyu plakası tedavi steril bir doku kültürü hazırlamak ve hücrelerin kültürlü olacak kuyuları belirlemek. Daha önce bu kuyularda hazırlanan 2x bazal ortamın 100 mikrolitresini aktarın. NR iyi işaretlenmiş olarak, 100x nikotinamid ribozoside çözeltisi iki mikrolitre ekleyin.
Boyama kontrolü için 100 mikrolitre 2x bazal ortamı kuyulara aktarın. 2x bazal orta içeren kuyuların üstüne hazırlanmış hematopoetik kök hücrelerin tohum 100 mikrolitre. Tohum 100 tüm kemik iliği hücrelerinin mikrolitre boya kontrolleri olarak işaretlenmiş kuyular üzerinde.
Hücreleri içeren kuyulardan buharlaşmayı azaltmak için çevredeki tüm kuyulara 200 mikrolitre otoklaved su ekleyin. Plakayı 37 derecede bir kuvözde 72 saat boyunca %5 karbondioksitle rahatsız edilmeden yerleştirin. Her 24 saatte bir nikotinamid riboside doldurmak için plakayı çıkar ve kuvöze geri koy.
Kültür döneminin sonunda, test kuyularının her birine iki mikrolitre 100x TMRM çözeltisi ve iki mikrolitre 100x yeşil floresan leke çözeltisi ekleyin. TMRM boyama kontrolüne iki mikrolitre 100x TMRM ekleyin. MitoTracker boyama kontrolü iyi 100x yeşil floresan leke iki mikrolitre ekleyin.
Alüminyum folyo ile plakanın üst kapağı. ve plakayı 45 dakika boyunca %5 karbondioksitte 37 derecede bir kuvöze yerleştirin. Tabağı kuvözden çıkarın ve 5 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj edin.
Supernatant kaldırmak için plaka ters ve yeniden askıya almak için standart FACS tampon 200 mikrolitre ekleyin. Plakayı folyo ile kapatın. Plakayı 5 dakika boyunca 300 kez g.'de santrifüj edin.
Bu yıkama adımLarını üç kez tekrarlayın. 200 mikrolitre FACS tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın ve FACS tüplerine aktarın. Akış sitometresindeki örnekleri çalıştırmak için, önce tek renk denetimlerini makineye yükleyin ve her birinde en az 5.000 olayı tek tek kaydedin.
Yazılımda, tek renk denetimleri elde etmek ve kaydetmek için Satın Al ve ardından panoya Kaydet'e basın. Telafi Kurulumu'na basın ve tazminatı hesaplamak için Telafi Hesapla'yı tıklatın. Tazminat uygulandıktan sonra hematopoetik kök hücre örneğini alın ve mümkün olduğunca çok olay kaydedin.
Sitometreden FACS dosyalarını dışa aktarın ve analiz yazılımındaki dosyayı açın. FlowJo'da, hücre popülasyonunu tanımlamak için ileri dağılım ve yan dağılım gating kullanın. Sonraki kapılardaki singlet'leri belirleyin ve canlı hücreleri temsil eden DAPI negatif fraksiyonu çizin.
Canlı hücre kapısında, sırasıyla mitokondriyal membran potansiyelini ve kütlesini ölçmek için TMRM ve yeşil floresan leke kanalında bir kontur çizimi yapın. Canlı hücre kapısında bu iki kanalın ortalama floresan yoğunluğunu dışa aktarın. Daha sonra, tüm örneklerde TMRM düşük kapıdaki hücrelerin oranını dışa aktarın.
Nikotinamid ribozoside tedavi TMRM düşük nüfus net bir artış gösterdi. Ayrıca TMRM düşük kapıdaki hücrelerin oranını önemli ölçüde artırdı ve TMRM floresan yoğunluğunun önemli ölçüde azaldığını gösterdi. Mitokondriyal kitle nikotinamid ribozit takviyesi üzerine değişmedi.
Ayrıca, kök hücre marker boyama mitokondriyal boyama sonrası kültür ile kombine edildi. Hematopoetik kök hücreleri tanımlamak için gating stratejisi ile, nikotinamid ribozoside maruz kalma TMRM düşük nüfus önemli bir artış ve kapılı HSCs TMRM floresan yoğunluğunda önemli bir azalma gösterdi. Yeşil floresan mitokondriyal leke yeşil sinyal iki koşulda değişmeden kaldı.
Lekeli numunelere ışık maruziyetini en aza indirmek için boyama plakasının alüminyum folyo ile kaplanması önemlidir. Bu yöntem, kök hücrelerinizin işlevselliğini belirlemek için kemik iliği nakli ve koloni oluşturan tahliller gibi alt akım denemeleri ile kombine edilebilir. Yani bu teknik HSC'lerin yeni metabolik modülatörlerinin tanımlanması için basit bir tarama yöntemi sağlar.
