Questo protocollo è un semplice saggio basato sulla citometria a flusso che consente di misurare il potenziale della membrana mitocondriale e la massa mitocondriale nelle cellule viventi. I test metabolici standard falliscono quando si lavora con popolazioni rare come le cellule staminali ematopoietiche. Questo metodo consente agli utenti di profilare la membrana mitocondriale quando lavorano con un basso numero di cellule e di determinare nuovi modulatori metabolici di cellule come gli HSC.
Inoltre, puoi combinarlo con saggi funzionali a valle come il trapianto di midollo osseo o test di formazione della colonia per determinare la funzionalità delle tue cellule dopo la coltura. La nostra tecnica può essere sfruttata per l'identificazione di nuove molecole in grado di migliorare la funzione HSC nel contesto del trapianto di midollo osseo e del recupero immunitario ematopoietico dopo terapie ablative. Come descritto nel nostro protocollo, il nostro metodo può essere utilizzato per valutare la forma metabolica delle cellule T immunitarie.
È molto importante che le cellule abbiano una minima esposizione alla luce dopo la colorazione. Inoltre, l'uso dell'inibitore della pompa verapamil deve essere incluso per valutare il contributo dell'efflux della pompa. Tuttavia, gli utenti devono essere consapevoli del fatto che il verapamil perturba profondamente l'equilibrio ionico e non può essere utilizzato per valutare l'effetto di un modulatore metabolico sul potenziale della membrana mitocondriale.
La dimostrazione visiva di questo metodo è estremamente importante perché ci sono alcuni passaggi critici che è necessario tenere a mente quando si lavora con un numero ridotto di celle e questi passaggi sono molto spesso mancanti nei documenti regolari che gli utenti leggono su PubMed. Per lo smistamento FAC, viene identificata la popolazione LKS, definita da lignaggio negativo, Sca1 positivo, cKit positivo. Le cellule staminali ematopoietiche provenienti da circa il cinque al 10% delle cellule della popolazione LKS sono identificate dalla gating per la popolazione positiva cd150, CD48 negativa, etichettata come HSC.
Dopo lo smistamento delle cellule staminali ematopoietiche, centrifugare i tubi a 300 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere delicatamente la maggior parte del supernatante senza sganciare il pellet e lasciare da 50 a 80 microlitri sopra il pellet cellulare. Resuspend il pellet cellulare nel mezzo di espansione delle cellule staminali fino ad un volume finale di 200 microlitri.
Preparare una coltura tissutale sterile trattata con 96 piastre del pozzo a U-bottom e identificare i pozzi in cui verranno coltivate le cellule. Trasferire 100 microlitri di mezzo basale 2x precedentemente preparato in questi pozzi. Nella NR contrassegnata bene, aggiungere due microlitri di una soluzione di riboside di nicotinammide 100x.
Trasferire 100 microlitri di mezzo basale 2x in pozzi per il controllo della colorazione. Seme 100 microlitri di cellule staminali ematopoietiche preparate sopra i pozzi contenenti 2x mezzo basale. Sementi 100 microlitri di cellule intere del midollo osseo su pozzi contrassegnati come controlli di colorazione.
Aggiungere 200 microlitri di acqua autoclavata in tutti i pozzi circostanti per ridurre l'evaporazione da pozzi contenenti cellule. Posizionare la piastra indisturbata in un'incubatrice a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per 72 ore. Estraere il piatto per reintegrare il riboside di nicotinammide ogni 24 ore e rimetterlo nell'incubatrice.
Alla fine del periodo di coltura, aggiungere due microlitri di soluzione TMRM 100x e due microlitri di soluzione di macchia fluorescente verde 100x in ciascuno dei pozzi di prova. Aggiungere due microlitri di TMRM 100x nel pozzo di controllo della colorazione TMRM. Aggiungere due microlitri di colorazione fluorescente verde 100x nel pozzo di controllo della colorazione MitoTracker.
Coprire la parte superiore della piastra con un foglio di alluminio. e riposizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per 45 minuti. Rimuovere la piastra dall'incubatrice e centrifugarla a 300 volte g per cinque minuti.
Invertire la piastra per rimuovere il supernatante e aggiungere 200 microlitri del buffer FACS standard per rimescolare. Coprire il piatto con un foglio. Centrifugare la piastra a 300 volte g per cinque minuti.
Ripetere questo passaggio di lavaggio tre volte. Rimospendare le cellule in 200 microlitri di tampone FACS e trasferire ai tubi FACS. Per eseguire i campioni sul citometro di flusso, caricare prima i singoli controlli colore nella macchina e registrare almeno 5.000 eventi in ciascuno per uno.
Nel software premere Acquisisci e quindi Registra nel dashboard per acquisire e registrare controlli a colori singoli. Premere Setup retribuzione e fare clic su Calcola retribuzione per calcolare la retribuzione. Una volta applicata la compensazione, acquisire il campione di cellule staminali ematopoietiche e registrare il maggior numero possibile di eventi.
Esportare i file FACS dal citometro e aprire il file sul software di analisi. In FlowJo, utilizzare la dispersione in avanti e la dispersione laterale per identificare la popolazione cellulare. Identificare i singoletti nei gate successivi, quindi tracciare la frazione negativa DAPI che rappresenta le celle vive.
Nel cancello della cellula viva, creare un appezzamento di contorno nel canale di macchie fluorescenti TMRM e verde per misurare rispettivamente il potenziale e la massa della membrana mitocondriale. Esportare l'intensità media di fluorescenza di questi due canali nel cancello della cellula viva. Quindi, esportare la proporzione di celle nel cancello basso TMRM in tutti i campioni.
Il trattamento con riboside nicotinammide ha mostrato un chiaro aumento della bassa popolazione di TMRM. Ha anche aumentato significativamente la proporzione di cellule nel cancello basso TMRM e ha mostrato un significativo abbassamento dell'intensità di fluorescenza TMRM. La massa mitocondriale non cambiò con l'integrazione della nicotinammide riboside.
Inoltre, la colorazione marcatore delle cellule staminali è stata combinata con la colorazione mitocondriale post-coltura. Con la strategia di gating per identificare le cellule staminali ematopoietiche, l'esposizione al riboside nicotinammide ha mostrato un aumento significativo della bassa popolazione di TMRM e una significativa diminuzione dell'intensità di fluorescenza TMRM negli HSC gated. Il segnale verde fluorescente mitocondriale verde è rimasto invariato nelle due condizioni.
È importante coprire la piastra di colorazione con foglio di alluminio al fine di ridurre al minimo l'esposizione della luce a campioni macchiati. Questo metodo può essere combinato con saggi a valle come il trapianto di midollo osseo e test di formazione della colonia per determinare la funzionalità delle cellule staminali. Quindi questa tecnica consente un semplice metodo di screening per l'identificazione di nuovi modulatori metabolici degli HSC.
