微生物が個々の二重層の化学組成をどのように調節するかを研究することは、抗生物質の殺傷、抗菌性および疾患病因のメカニズムに関する我々の知識を知らせるだろう。この技術は、グラム陰性細菌の細胞エンベロープを洗剤を使用せずに2つの定義された分数に分割する。したがって、脂質、タンパク質および糖は、半ネイティブである環境で評価することができる。
一部のステップは時間に依存し、フォーカスと調整が必要です。最初は、1 つまたは 2 つのサンプルを使用します。快適性レベルが上がると、より多くのサンプルを追加できます。
一度に6つ以下のサンプルを扱う必要があります。これは複数日の手順であり、目視チェックポイントは、有効性とエラーを評価するのに役立ちます。これを実行する前に、時には最終ステップを実行します。
冷凍グリセロールストックから新鮮な寒天プレートに細菌をストリーク。コロニーが発達したら、プレートを摂氏4度で保管します。単一コロニーを使用して、スープ培地で満たされた5ミリリットルのチューブを接種し、所望の一晩で細菌を培養する。
バックは、好ましいブロス培地の1リットルに一晩細菌培養物を希釈し、フラスコをインキュベートします。望ましい光学密度が得られたら、インキュベーターからフラスコを取り出し、氷の上に置きます。600ナノメートルで培養液の光学密度を測定し、11番目の細菌コロニー形成ユニットの6〜8倍の間に相当する培養量を計算します。
遠心分離管にこの量の培養液を加え、残りの培養物が使用されるまで氷の上にとどまるようにします。ペレット菌は、固定角度で10分間遠心分離し、高速遠心分離機を7,000~10,000倍Gと摂氏4度でペレット化する。上清を慎重にデカントし、廃棄します。
各細胞ペレットを12.5ミリリットルのバッファーAに再懸濁し、磁気攪拌バーを細胞懸濁液に加えます。各細胞の再懸濁液に1ミリリットル10ミリグラムの180マイクロリットルを加えます。遠心分離によってリソチームEDTA処理細菌を採取した後、プロテアーゼ阻害剤、塩化マグネシウムおよびヌクレアーゼを細菌に素早く添加し、細胞を緩衝B.Stir中で2分間急速に再懸濁し、懸濁液を氷上に保ちます。
次に、各細胞の再懸濁液に1.5ミリモルEDTA溶液12.5ミリリットルを加え、さらに7分間氷上で攪拌を続けます。15ミリリットル円錐形チューブに懸濁液をデカントします。サスペンションを摂氏4度で10分間9,000~11,000倍Gで遠心分離します。
上清をバイオハザード廃棄物容器に捨て、氷の上にペレットを保持します。各細胞ペレットに25ミリリットルのバッファーBを加える。次に、塩化モルマグネシウム1個55マイクロリットル、rnase/dnase/ヌクレアーゼ試薬1マイクロリットル、プロテアーゼ阻害剤カクテル1マイクロリットルを加えます。
混合物中のペレットを再中断します。溶液が均質に見えるまで、激しくピペットと渦。懸濁液を氷の上に保管してください。
ホモジナイザーのサンプルシリンダーにサンプルを注ぎ、20,000 PSIにセルを持って来ます。病原体のエアロゾル化を避けるために、加圧装置をバッファーBに入れ、細菌懸濁液を加える前に圧力レベルを調整します。予防措置として、圧力セルとバッファーBの10ミリリットルをほのめかします。
また、氷の上にサンプルを維持しながら、氷の上に50ミリリットルの円錐管に細胞ライセートを収集します。完全なリシスを達成するには、このプロセスを3〜5回繰り返します。残りのペレットに、そのまま、細胞材料、6、169回Gおよび4度摂氏10分間での分離菌サンプルを遠心分離する。
現在、均質化された膜を含む上清をポリカーボネートボトルに分配して超遠心分離します。超遠心分離機細胞は、少なくとも1時間、184、500倍G、摂氏4度でライセートする。上清を捨て、氷の上に膜ペレットを保持します。
ガラスを用いて、Dounceホモジナイザーは、低密度イソピクニックショ糖勾配溶液の1ミリリットルで膜ペレットを再懸濁する。次に、ガラスのパスツールピペットを使用して、サンプルホモジネートを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、チューブを氷の上に置きます。スクロース勾配を調製するには、ポリプロピレンまたは超透明のオープントップチューブをわずかに傾けた位置に保持します。
より高密度のスクロース溶液を2ミリリットルゆっくりと添加します。次に、低密度スクロース溶液の4ミリリットルを加える。密度勾配を調製する際には、スクロース溶液をゆっくりと添加して、層を混合しないようにします。
スクロースレイヤーはわずかに表示され、一般的に定義されているように見える必要があります。次に、以前に低密度の1ミリリットル、イソピクチンスクロース溶液に再懸濁した全膜画分を加える。最後に、低密度の約6ミリリットルのイソピクニックショ糖勾配溶液を添加して、チューブの残りの部分を充填します。
288、000倍G、摂氏4度のスイングバケットローターを16〜23時間使用してサンプルを超遠心分離します。P1000ピペットチップをポイントから約5ミリリットル切り落とします。遠心分離が完了したら、ピペットを使用してチューブから上の茶色の層を取り除きます。
内膜分率を含むこの層を、超遠心分離のためのポリカーボネートボトルに移します。53%スクロースと73%スクロースの間の界面の上に約2ミリリットルのスクロース溶液を残して、下部、白、外膜分画が内膜分率を汚染しないようにします。再び、P1000ピペットチップを使用して、端を取り除き、外膜層を除去し、ポリカーボネートボトルに移します。
ポリカーボネートボトルの残りの空隙を単離膜貯蔵バッファーで満たし、反転またはピペットによって混合します。氷の上にサンプルを保持します。膜を収集するために、ポリカーボネートボトルを184、500倍G、摂氏4度で1時間超遠心分離する。
最後に、上清を捨て、500~1,000マイクロリットルのストレージバッファを追加します。Dounce均質化によって膜を再懸濁する。2ミリリットルのマイクロ遠心チューブでサンプルを収集します。
全膜ペレットを掻き取り、Dounceホモジナイズ化し、スクロース密度勾配を超遠心化して内膜と外膜を分離した。20%53%73%のスクロース密度勾配は、いくつかの細菌株を区分するのに十分であった。しかし、20%45%73%の勾配を使用して正常に分割されたA.baumanniiを分割する必要はありません。
分離の効率を評価するために、膜サンプルは、細菌内膜に位置する酵素であるNADHデヒドロゲナーゼについて試験した。340ナノメートルでの光学密度の低下は、酵素の存在を示した。光学密度は、野生型S.typhimurium、大腸菌K12 DH5aおよびgalE変異体S.typhimuriumからの内および外膜画分の50マイクログラムサンプルについて測定した。
50マイクログラムを使用した最初のアッセイでは、NADHデヒドロゲナーゼの相対レベルが他の細菌株よりもA.baumannasiiの相対レベルが低いことが示唆されたため、A.baumannii膜画分の純度をアッセイする際に、より高い濃度のタンパク質が追加された。外膜画分を有する内膜画分の交差汚染を評価するために、LPSおよびLOSを抽出し、可視化した。抽出物をポリアクリルアミドゲルにロードし、Pro-Qエメラルド300で染色した。
アシネトバクターバウマンニは、最優先の多剤耐性、ヒト病原体である。このプロトコルは、研究者がこのユニークで重要な病原体の抵抗および病原性メカニズムにおけるリプーリゴ糖、リン脂質およびリポタンパク質の役割を理解する上で役立つべきである。この方法は、グラム陰性細菌の二重膜内に典型的に存在するリン脂質、糖脂質炭水化物、タンパク質および小分子の下流分析に理想的である。
