このプロトコルは、遺伝子型、表現型、および薬物反応の研究に適した、再現性のある免疫適格PDACin vivoモデルを提供します。この技術の主な利点は、実験の再現性を維持しながら、同系の生物学的腫瘍微小環境で腫瘍の進行を調査するのに役立つことです。手順を実演するのはステファニー・バーテルとキアラ・ファルコマタで、どちらも私たちの研究室の出身です。
T75培養フラスコ内で増殖させた膵管腺癌(PDAC細胞)をリン酸緩衝生理食塩水またはPBSで洗浄することにより、腫瘍細胞の調製を開始します。次に、0.5ミリリットルのトリプシンを5〜10分間加えてフラスコから取り外します。剥離した細胞を10ミリリットルのDMEMに10%ウシ胎児血清(FBS)と0.1%ペニシリンストレプトマイシンを加えて再懸濁してから、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。
細胞懸濁液を200Gで5分間遠心分離し、上清を吸引する。注射用細胞の必要な最終濃度に基づいて、添加剤なしで細胞ペレットをDMEMに再懸濁します。ノイバウアーチャンバーを使用して、10マイクロリットルの細胞懸濁液中の細胞をカウントし、利用可能な細胞の数を計算します。
最終的に必要な濃度に従って、1ミリリットルの希釈懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。細胞の凝集を防ぐために、移植されるまでチューブをローテーターに置きます。PDAC細胞の同所性移植では、マウスが眠っている間に鎮痛マウスにアイクリームを塗布します。
鎮痛マウスの左外側腹部を剃る前に、十分な鎮痛を確認してください。右側に横たわっているマウスを滅菌加熱マットの上に置き、脚を表面にテープで固定します。新しい手袋を着用して消毒してください。
手術用ハサミを使用して、脾臓が突出している左脇腹の皮膚と皮下脂肪組織を縦方向に約1センチ切ります。はさみと鉗子を使用して、腹膜へのアクセスを容易にするために腹膜から皮膚を分離します。1センチメートルの縦方向のカットで脾臓の場所で腹膜を開く前に、はさみのペアを交換してください。
鈍くて細い先端の鉗子を使用して脾臓と付着した膵臓を動員しながら、臓器が他の組織に付着していないことを確認します。また、膵臓を取り扱う際に血管や周囲の組織を傷つけないように、供給されている血管を確認してください。膵臓を切開部から慎重に引き出して、臓器の尾部にアクセスしやすくし、膵臓に続く脾臓を観察します。
こぼれないように、注射中に臓器が折りたたまれていないこと、および臓器のカプセルが針貫通部位で張力をかけられていることを確認してください。目に見える血管の間に膵臓組織を狙って、血管に穴を開けたり注射したりするリスクを最小限に抑えます。利き手を使用して、臓器の縦軸に沿って27ゲージのカニューレと50マイクロリットルのシリンジで臓器のカプセルを慎重に貫通します。
2, 500個の細胞を含む20マイクロリットルの懸濁液を膵臓の尾部に注入した後、腫瘍細胞がこぼれないように膵臓と挿入された注射器を約1分間静止させます。次に、注射部位から針を取り外します。次に、細胞がこぼれないように、組織を傷つけずに腹部内の臓器を慎重に再配置します。
臓器に1ミリリットルの0.9%塩化ナトリウムを注ぐことにより、臓器の癒着を回避します。簡単な中断縫合技術を使用して腹膜を縫合した後、2〜3個の9ミリメートルのステンレス鋼の巻線クリップを使用して皮膚を閉じます。次に、マウスの体重に応じてAFNを皮下注射して、ミダゾラム、メデトマジン、フェンタニル、またはMMFで鎮痛鎮静を拮抗します。
完了したら、マウスが目覚めて完全にアクティブになるまで、摂氏37度に加熱されたチャンバーにマウスを置きます。アクティブなマウスを元のケージに戻し、毛皮、肌の色、活動を確認してマウスの健康状態を監視し、手術後3〜4時間繰り返します。移植マウスのMRIでは、PDAC細胞の生着は、注入された細胞数と接種された細胞株の攻撃性および増殖特性に応じて、術後約7日で最も早く腹部触診されました。
得られた移植マウスの生存率は、細胞株の腫瘍細胞固有の特徴に応じて変化した。膵内注射が成功すると、マウスの膵臓に本格的な腫瘍ができました。対照的に、移植に失敗した場合、非生存細胞の注入、移植された細胞の拒絶、または不十分な数の細胞の注入のために、膵臓腫瘍がなくなりました。
注射中に細胞をこぼさないように注意し、細胞が腹部内に広がるのを防ぐために周囲の組織を傷つけないように注意してください。この手順に続いて、前臨床薬物応答研究のようなin vivo研究を免疫コンピテントマウスで実施し、続いて、例えば、事実、配列決定、または組織学的分析を行って腫瘍宿主相互作用を調査することができる。
