単一細胞mRNAシーケンシングは、単一細胞レベルでの生物学的プロセスを理解するために広く使用されている。多重化戦略の出現は、単一の実験で複数のサンプルのプロファイリングを可能にし、コストを大幅に削減し、バッチ効果を回避することによって、増幅をさらに拡大しました。この手順のデモンストレーションは、ポスドクのウェイ・フェンと、私の研究室の技術者アンドリュー・プジシンダです。
カウント後、胚18.5日目の心臓室から分離した細胞を5倍の10から5番目のアリコートに分割し、洗浄ごとに新鮮なPBSで細胞を2回洗浄する。サンプルあたりPBSの180マイクロリットルでペレットを再懸濁し、穏やかな混合と各チューブにアンカーバーコードストック溶液の20マイクロリットルを追加します。氷の上に5分間のインキュベーションの後、20マイクロリットルの共同アンカーバーコードストック溶液を各チューブに加え、氷上でさらに5分間のインキュベーションを行い、1回の洗浄で1ミリリットルの冷たいPBSで細胞を3ミリリットル洗浄し、チューブあたり1つの40マイクロメートルセルストレーナーを通してサンプルを新しいチューブにフィルターします。
カウント後、チップBをチップホルダーに組み立て、50%グリセロール溶液の75マイクロリットルを1行目の未使用の井戸に、40マイクロリットルを2行目の未使用の井戸に、280マイクロリットルを3行目の未使用の井戸に加えます。ここでは、手順を示すためにトレーニング チップを使用します。優しいピペットでマスターミックスに細胞懸濁液とヌクレアーゼフリー水の適切な量を追加します。
結果として得られたセル溶液の75マイクロリットルを、気泡のない行の1の行ウェルの下の中央に加えます。ゲルビーズを30秒間ボルテックスしてから、泡のない2列目のゲルビーズの底中央に40マイクロリットルのビーズをゆっくりと加えます。3列目の仕切油井戸のサイドウォールに280マイクロリットルの仕切油を加えます。
ガスケットを押さずにガスケットをチップに取り付け、ガスケットを水平に保ち、ガスケットを濡らさないようにします。組み立てたチップをクロムコントローラにガスケットでセットし、クロム単一セルBプログラムを実行します。画面にはトレーニングチップのクロムトレーニングが表示されますが、実際の実験ではクロム単一セルBが表示されます。
蓋を折り返して45度の角度で井戸を露出させ、液体レベルをチェックして下駄がないことを確認します。回復の最も低い点からエマルジョン中のゲルビーズの100マイクロリットルをゆっくりと吸引し、ビーズの均一性を確認する。乳化ビーズを氷上の新しいPCRチューブの壁に分配し、逆転写のためにサーマルサイクラーにチューブを入れます。
cDNAを増幅用に準備するには、室温で125マイクロリットルの回収剤をサンプルに加えます。不透明な液体は観察されず、ピペットや渦を避けてください。60秒待ってから、ゆっくりとチューブの底から回収剤を取り出し、200マイクロリットルの渦ビーズのクリーンアップ混合物をサンプルに加えます。
混合物を10回ピペットしてから室温で10分間インキュベートする。次に、サンプルを磁石の上に高い位置に置きます。溶液がクリアされたら、上清を取り除き、80%エタノールの200マイクロリットルをペレットに加えます。
30秒後、エタノールを取り除き、さらに2回洗浄を繰り返します。最後の洗浄後、サンプルを短く遠心分離し、低い位置でマグネットの上にチューブを置き、サンプルが2分未満乾燥するようにします。サンプルが乾燥したら、マグネットからチューブを取り出し、作りたての溶出液を35.5マイクロリットル加えます。
室温で2分間のインキュベーションの後、溶液がクリアされるまで磁石の上にサンプルを置き、サンプルの35マイクロリットルを新しいチューブストリップに移します。脂質ベースのバーコード戦略を用いたcDNA増幅の場合、35マイクロリットルcDNAサンプルに増幅反応混合物を加え、遠心分離を簡単に行う前に完全混合を行います。スピンの終了時に、適切なcDNA増幅手順に従って、サーマルサイクラーにサンプルをインキュベートします。
120マイクロリットルの選択試薬と100マイクロリットルの超純水を100マイクロリットルのサンプルに加え、得られた0.6倍の選択試薬を15回ピペットします。室温で5分間のインキュベーションの後、溶液が明らかになるまでサンプルを磁石の上に置きます。バーコード化されたcDNAライブラリ構造を多重化するために、上清を1.5ミリリットルの低結合チューブに移します。
上清の内容がバーコード化されたcDNAと内因性cDNAのベース内容を組み立てるので、上清とベースの両方を保存することを忘れないでください。80%エタノールで内因性cDNAを洗浄し、40マイクロリットルの溶出バッファーでDNAを溶出し、内因性転写ライブラリを準備する前に内因性cDNAの品質管理チェックを実行します。cDNA濃度は、ライブラリの構築前に定量化し、修飾する必要があります。
内因性の cDNA ライブラリやバーコード ライブラリを含む構築されたライブラリも、シーケンス処理の前に定量化および修飾する必要があります。シーケンス処理後、バーコード式は各セルで分析できます。例えば、この分析では、8種類の異なるサンプルから1種類のバーコードを表すバーコードを一意に発現した8つのグループの単一細胞が観察された。
さらに、一部のセルはバーコードを表さなかったため、負のセルとして定義され、他のセルは2つの異なるバーコードを表す2つの異なるバーコードを表しました。単一細胞を用いて、細胞の異種性および分子規制は、細胞型注釈、新規および稀な細胞型同定、解剖学的領域比較分析、および細胞周期相分離などの遺伝子オントロジー経路解析によって評価することができる。可能であれば、エマルジョンでゲルビーズを画像化すると、この時点まで手順が成功したかどうかが画像でわかります。
サンプル多重化により、実験の設計に大きな柔軟性が加わることができます。このデモンストレーションを見て、あなた自身の実験を始めることに自信を持っていければと思います。
