膜タンパク質を抽出して研究する古典的な方法は、洗剤の単純な可溶化です。これは、単純かつ普遍的な方法を提供しながら、洗剤は、これらの敏感なタンパク質のネイティブ構造、機能および活性を変更することが示されている。ここでは、洗浄剤を含まない溶液中の膜タンパク質を安定化させる溶液として、ペプチドディスクを提示する。
Peptidisc システムは、無数の膜タンパク質の大きさ、形状、および類型に自発的に適応します。これは、多くの場合、退屈な最適化を必要とする他の膜模倣とは対照的です。大腸菌外膜タンパク質であるFhuAは、このプロトコルで再構成されるモデル標的タンパク質として使用される。
外膜小胞は、膜タンパク質を可溶化するための洗浄剤の添加に続いて単離される。ペプチドは可溶化に添加され、洗剤は希釈され、自発的にペプチドディスケア粒子を形成する。これらの安定化された可溶性粒子は、現在、多数の下流の用途に適しています。
このプロトコルは、ペプチドディスク技術の応用としてバイオ層干渉法を検討する。このプロトコルは、膜タンパク質の同時精製と再構成を容易にする有用な技術であるPeptiQuick再構成法に焦点を当てます。オンビーズ再構成のPeptiQuick方法は、洗剤で事前平衡化された標準ニッケル-NTA IMAC重力カラムで行われる。
可溶化した膜を樹脂にロードし、非標的タンパク質を洗い流します。このペプチドをカラムに添加した後、洗剤を急速に希釈する。ペプチドペプチドの疎水性側は、露出した疎水性領域と関連する。
ペプチドの親水性側は、溶液中で可溶性のタンパク質を保ちます.過剰なペプチドが洗い流される。イミダゾールは、再構成された怒りを溶かすために追加されます。
Peptidisc スキャフォールドは、間接的にメモリタンパク質にラベルを付け、より広範なダウンストリーム分析への扉を開くために機能化される可能性があります。ここでは、BLI分析のためにストレプトアビジン被覆センサへの取り付けにビオチン化ペプチドを利用します。バイオレイヤ干渉法は、溶液中の生体分子相互作用を調査するための強力なラベルフリー技術です。
この手法は、単に相互作用を示すだけでなく、リアルタイムの運動読み出しを提供し、結合解離定数の計算を可能にします。このプロトコルを通じて、我々は、この活動を変更することができるので、BLI分析中に洗剤の必要性を排除します。バイオレイヤインターフェログメトリーは、相互作用中にセンサー、またはチップから反射された白色光の干渉を解析します。
相互作用を測定するために、センスチップは、各ステップで記録されたソリューションと信号の間で渡されます。各ヒントは、センソグラム上で独自のトレースを与えます。まず、バッファのベースラインのみが確立されます。
第二に、リガンドが結合される。この場合、FhuAおよびビオチン化されたペプチディスは、レンサプタビジンを包み込んだ先端に結合する。次に、先端を緩衝液中で洗浄し、任意の非結合FhuAを除去する。
今、先端は、既知の濃度の検体を有する溶液に移動され、ここでColM。相互作用が発生した場合、これは結合曲線を与えます。最後に、先端をバッファに移動し、解離を測定します。
各カラム濃度における関連と解離の観測率を使用して、解離定数を計算することができます。ヘキサヒスチジンタグ付きFhuAは、アミン培地中で18時間の間、大腸菌株AW740で発現される。細菌は摂氏4度で5,000 Gの10分で遠心分離によって収穫される。
得られた細胞ペレットはTSGバッファーに再懸濁され、その後、細胞塊を分解し、徹底的な分解を確実にするためにダウンスされます。TMSFは、リシス直前に1ミリモルの最終濃度に再懸濁細胞に加える。細胞のリシスは、15,000 PSIのマイクロ流体装置または8,000 PSIのフレンチプレスを介して3つの通路によって達成される。
この細胞を回収し、4度で10分間5,000Gで低速遠心分離を行う。低速スピンからの上澄み物はTI70超遠心分離機ローターにロードされ、粗大腸菌膜をペレットするために4度で40分間200,000 Gで遠心分離されます。超遠心分離の後、上清は廃棄され、粗膜ペレットはTSG緩衝液の最小量で再懸濁される。
粗膜は、その均質性を確保するためにダウンスされます。ブラッドフォードアッセイは、再懸濁された粗膜のタンパク質濃度をチェックするために行われます。TSGバッファーは、可溶化前に1ミリリットル当たり約3ミリグラムに粗膜を希釈するために使用されます。
トリトンX-100は、細菌内膜を選択的に可溶化するために、最終濃度1%で再懸濁された粗膜に添加される。可溶化は、穏やかな揺れで、4度で1時間行われます。非可溶化された外膜は、4度で40分間、200,000 Gで超遠心分離によって単離される。
可溶化した内膜を含む得られた上清は廃棄される。外膜を含むペレットは、TSGで以前のように再懸濁される。LDAOは、再懸濁外膜に1%の最終濃度に添加され、4度で1時間可溶化する。
最後に、前と同様に、ペレット不溶性物質に対して超遠心分離が行われる。結果として生じる上清は、私たちのターゲット、彼のタグ付けされたFhuAを含む可溶化された外膜を含み、同時IMAC浄化とペプチディスク再構成の準備が整いました。ニッケル NTA IMAC 重力カラムは、IMAC 洗浄バッファーの 2 つのカラムボリュームで事前平衡化されています。
イミダゾールは、可溶化した外膜に5ミリモルの最終濃度で添加され、0.04%LDAOに希釈される。可溶化した外膜をニッケルNTA樹脂に積み込み、流れが集められる。この流れは、FhuAの樹脂結合を増加させるために樹脂にリロードされる。
装填後、樹脂を250ミリリットルのIMAC洗浄バッファーで洗浄し、最初の50ミリリットルを回収した。洗浄後、洗浄バッファーは樹脂ベッドの高さのすぐ上まで排出され、カラムストップコックは閉じた。1ミリリットルの濃縮物、1ミリリットル当たり10ミリグラム、ペプチドディスペプチドがカラムに添加される。
濃縮ペプチドの添加に続いて、50ミリリットルの希薄化、1ミリリットル当たり1ミリグラム、TSG中のペプチドペプチドが添加される。樹脂を撹拌してビーズをTSGに再懸濁させ、LDAOのCMCの下に、ペプチディスク粒子を形成する。ペプチディスクトラッピング後、樹脂は沈着させ、1ミリリットルのペプチド溶液を1ミリグラムずつ樹脂を通して排出する。
この樹脂を50ミリリットルのTSGで洗浄し、過剰なペプチドを除去する。最後に、ペプチドディスック粒子をTSGで600ミリモルイミダゾールの50ミリリットルで希釈する。1ミリリットル分分が集まり、0.5モルEDTAの10マイクロリットルが添加され、ニッケルイオンを浸出したキーライトである。
開始、流れ、洗浄、および排除された分画を12%SDSゲルにロードし、60ミリアンペアで30分間電気ホレズします。ゲルはゲルの走査器で染色され、視覚化される。得られたゲルは、流れにおけるFhuAの枯渇と溶出中の濃縮を示す。
軽度の汚染物質バンドも、排除された分数で観察される。FhuA Peptidisc溶解度を確認し、汚染物質を枯渇させるために、サイズ排除クロマトグラフィーに3~7個のフラクションが選択されます。遠心濃縮器を遮断した30キロドームは、画分を3から7まで集中させるために使用される。
プールされたIMACのエルション分率の1ミリリットルは、TSGバッファー内の毎分0.25ミリリットルの流量でS200カラムに注入される。1ミリリットルの分画を収集し、12%SDSゲルの画分を実行します。関連する分数はプールされ、ダウンストリーム アプリケーションで使用できるようになりました。
BLIはフォルテビオ八重奏RED96で行われました。この器械は最初に手で設定される96の井戸の版を渡ってBLIピンを動かす。すべての井戸は200マイクロリットルの最終容積に満ちている。
列 1 にキネティクス バッファーがロードされ、ヒントが平衡化してベースライン信号を形成できるようにします。カラム2は、リガンドおよびキネティクス緩衝液の事前決定された濃度をロードする。この場合、FhuAはリガンドであり、1ミリリットル当たり2.5マイクログラムの濃度に添加される。
行 E のヒントは参照として使用され、バッファーのみで読み込まれます。カラム3は、先端から余分なFhuAを洗浄するためにキネティクスバッファをロードする。この場合、コルMの検体の二重の連続希釈は、4列目の上から下にロードされます。
これらの濃度の最も高い値は、参照行に使用され、検体のチップへの非特異的結合を測定する。列 5 はバッファーでロードされます。ここで、ColMは解離し、解離を測定する。
プレートが準備されると、センサーチップトレイと準備されたプレートがBLI機器に積み込まれます。BLIデータ取得ソフトウェアを開き、新しい運動実験を開始します。[プレート定義]タブは、96 ウェル プレートのレイアウトをソフトウェアに入力するために使用します。
ここでリガンドFhuAは、検体ColMがサンプルとして入力されている間に負荷として入力される。アッセイ定義タブは、実験の各ステップの時間とプレート回転速度の長さを定義するために使用されます。ここでは、60秒のベースラインステップ、250秒のロードステップ、300秒の第2ベースラインステップ、450秒の解離ステップ、そして最後に900秒の解離ステップを含みます。
これらのステップは、希望のステップを選択し、各列のアッセイを右クリックして、96ウェルプレートの各カラムに個別に割り当てられます。センサー割り当てタブは、オクテット計器がセンサートレイの正しい位置からBLIピンを取っていることを確認するために使用されます。[テストの確認] タブには、実験の最終概要が表示されます。
BLIはオクテットレッドによって行われます。これにより、分析用の生データセンソグラムが生成されます。この解析は、最初にオクテットバイオデータ解析ソフトウェアを開くことによって行われます。
[データ選択]タブを使用して、実験を見つけ、実験の概要を確認します。検体ColMの濃度は、ここに入力されます。次に、プロセッシングタブを使用して、実験データから基準信号を引きます。
ベースラインは、Y 軸を合金分解率が適用されたかのように整列するように定義されます。最後に、プロセス データが選択されます。この実験ではデータが分離され、[曲線にフィット]が選択されます。
部分的な関連付けと解離カーブの適合が選択されます。Kd はこのフィッティングから計算されます。サイズ除外クロマトグラムは、アンビュートの再構成を検証するために使用されます。
クロマトグラムは、単一対称ピークを示し、単分散タンパク質調製を示唆する。ピークは、ボイド体積の後に数ミリリットルを溶出し、非凝集した可溶性ペプチディスク粒子を示す。タンパク質凝集体は空隙体積で溶出し、過剰な洗剤およびペプチドは主なピークに続いて溶出する。
まだニッケルNTAビーズに付着しながら形成されたPeptidiscsの洗浄を増加させ、この後者のピークを枯渇させるべきです。タンパク質凝集体は、再構成前に記憶タンパク質を洗剤フリー溶液にさらした結果がしばしば生じる。この最後の除外クロマトグラムは、再構成のトラブルシューティングに役立つ診断です。
実験データの処理に続いて、曲線はセンソグラムにフィットする。このフィッティングの精度は、解離定数の計算に不可欠です。残差図プロットは、実験データと計算フィッティングの差を示します。
これは、4つの異なるカラム濃度の3つの曲線がうまくフィットすることを示しています。しかし、最高濃度の曲線は良好な適合を生み出さない。これは、この高濃度で、ピンにカラムの異種結合があることを示唆している。
したがって、この最高濃度の信号はForteBioアプリケーションノートに従って運動分析から含まれていません。残りの 3 つのカーブは、運動解析に使用されます。BLIとペプチディスク法を用いて決定されるFhuAとColMの間の解離定数は、他の方法によって決定される定数と一致する。
等温熱量測定とナノディスク、およびマイクロスケール熱性熱性およびペプチディスクは、我々の決定値と有意に異ならない解離定数を生み出した。この一貫性は相互作用の動薬を測定するためのPeptidisc BLI方法を検証する。さて、このビデオを見た後、私たちはあなたがPeptiQuickメソッドの強さと警告の実用的な理解を得ていることを願っています。
この方法は、洗剤が完全に存在しない場合にFhuA ColM相互作用を定量化するのに特に有用であることがわかりました。そして、他の受容体とリガンドの相互作用を特徴付けるために同じワークフローを適用できると考えています。あなたの実験で幸運を祈ります。
