このプロトコルは、GPCRアゴニストの完全な機能的濃度応答関係を1つの細胞集団から記録し、低細胞サンプル数であっても詳細なアゴニスト特性評価を提供する。シリアル・ドージングの主な利点は、フル濃度応答解析に十分な単一のウェルであるため、スループットの増加です。この技術は、閉じたマイクロ流体容器のオルガンオンチップ形式のような、まれで複雑な生物学的モデルにおける単一の伝達を研究するのに適しています。
適切な機器が利用可能な場合、プロトコルを実行することは困難ではありません。適切な濃度でさまざまなGPCRリガンド溶液を調製することが成功の鍵です。大学院生のマイケル・スキバと、私たちの研究室の学部生アン・ミルドナーが手順をデモンストレーションします。
電極アレイにセルを播種する場合は、各電極アレイのウェルに適切な濃度のセルを追加し、セルを室温で10〜15分間ウェルボトムに均一に落ち着かせる。37°Cおよび5%の二酸化炭素で標準的な細胞培養インキュベーターで少なくとも36時間後、細胞層を位相対比顕微鏡で検査し、各電極を細胞で完全にカバーします。次に、各ウェルの細胞培養培地を、適切な量の事前温め、無血清培地に置き換えます。
インピーダンス記録を開始するには、インピーダンスアナライザの接続アレイホルダに電極アレイを配置し、電極とインピーダンスアナライザとの間の適切な低インピーダンス接触を確認します。ソフトウェアのユーザーインターフェイスで電極タイプやマルチウェル形式を選択します。単一および複数の周波数データ取得モードが使用可能で、分析するウェルの数が少ないか、時間分解能が重要でない場合は、複数の周波数記録を選択します。
最大時間の解像度を確保するには、1 つの監視頻度を選択します。次に、時間コースデータの取得を開始し、データを保存する場所のデータフォルダを選択します。インピーダンスの読み取り値は、8ウェルアレイのアゴニストモードでシリアル付加プロトコルを開始するには、細胞に関心のあるアゴニストの最も低い濃度の30マイクロリットルを追加するために、すべてのウェルの指定された周波数数で記録されます。
次に、細胞が応答し、アゴニストの各連続希釈が添加されるまで、次に最高濃度の30マイクロリットルを追加する前に、事前に定義された期間の平衡をとらせます。データを分析するには、アゴニスト解の最初の加算前の最後のデータポイントのインピーダンスを減算し、インピーダンス値を正規化するために加算ゼロの時間を設定します。正規化インピーダンスの時間経過をプロットし、個々の時間コースをプロットして、各追加ステップの後にインピーダンスの最大値を特定します。
これらの値を使用してデータシートを作成し、最大インピーダンス変化の値をアゴニスト濃度の関数としてプロットします。次に、データフィッティングルーチンを使用して、4パラメータロジスティックモデルを使用して半最大有効濃度と最大応答を決定します。本代表的実験では、ヒスタミン濃度を上げた10液を15分ごとに細胞に順次添加し、インピーダンスの変化を各時点で測定した。
インピーダンスの変化は、ヒスタミン濃度の関数としてプロットすることができ、7つのウェルから実験データポイントに取り付けられた4パラメータロジスティックモデルの伝達関数を得ました。ヒスタミン受容体のダウンレギュレーション、細胞脱感作、または過剰刺激を考慮して、この単一の連続ドージング実験に示すように、分析のためのデータ範囲を縮小することができます。3パラメータ最適化をデータに適用して、この分析に0.75プラスマイナス0.12マイクロモルの半分の最大有効濃度を提供することができます。
ヒスタミン受容体アンタゴニストジフェンヒドラミンの添加は、最初のヒスタミンの20分前に、連続的なドージングスキーム内のインピーダンスの遅延増加をもたらし、細胞応答を惹起する高アゴニストの必要性に対応する。用量応答関係において、アンタゴニストの効果は、曲線の右シフトとして表され、半最大有効濃度の増加に対応し、アンタゴニストがアゴニストに対して競合リガンドである場合である。シリアルドージングスキームの適用が成功することは技術的には簡単ですが、正確なタイミングですべてのステップを実行することは困難であるため、思慮深い計画が必要です。
シリアル・ドージングは、並列で監視されるサンプルの数に関して制限されている他の読み出しシステムで濃度応答研究を行う道を開きました。連続ドージングの特に利点は、細胞力学のような他の表向きの変化に敏感である全く新しい読み出しを用いて受容体媒介シグナル伝達の研究を可能にする。吸入や飲み込むと危険な場合があるため、受容体アゴニストのストック溶液を準備する際には手袋とゴーグルを着用してください。
