Этот протокол позволяет записывать полную функциональную реакцию на концентрацию агониста GPCR из одной популяции клеток и предоставляет подробную агонистную характеристику даже для низких номеров выборки клеток. Основным преимуществом серийного досирования является увеличение пропускной способности, поскольку одной колодец достаточно для полного анализа реакции на концентрацию. Этот метод хорошо подходит для изучения одной трансдукции в редких и сложных биологических моделях, таких как форматы орган-на-чипе в закрытых микрофлюидных контейнерах.
Протокол выполнения не трудно выполнить, при условии наличия соответствующего оборудования. Подготовка различных решений GPCR ligand при правильной концентрации является ключом к успеху. Майкл Скиба, аспирант, и Энн Милднер, студентка нашей лаборатории, продемонстрируют процедуру.
Для посева клеток на электродных массивах добавьте соответствующую концентрацию клеток в колодцы каждого электродного массива и позвольте клеткам однородно осесть на днища скважины в течение 10-15 минут при комнатной температуре. После по крайней мере 36 часов в стандартном инкубаторе культуры клеток при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе, осмотрите слои клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии, чтобы обеспечить полное покрытие каждого электрода клетками. Затем замените среду клеточной культуры в каждом хорошо с соответствующим объемом предварительно разогретой, без сыворотки среды.
Чтобы начать запись о неуступерии, поместите электродный массив в держатель соединительной решетки анализатора неустумности и подтвердите надлежащий низкий контакт между электродами и анализатором. Выберите тип электрода и/или формат мульти-хорошо в пользовательском интерфейсе программного обеспечения. Если доступны режимы получения одночастотных данных и количество проанализированных скважин является низким или разрешение времени не является критическим, выберите несколько частотных записей.
Для обеспечения максимального разрешения времени выберите единую частоту мониторинга. Затем начните сбор данных о времени и выберите папку данных для сохранения данных. Показания неуступаемого числа частот будут записаны на каждом колодец Чтобы инициировать протокол серийного добавления в агонистном режиме для восьми-хорошо массива, добавьте 30 микролитров наименьшей концентрации агониста интереса к клеткам.
Затем позвольте клеткам реагировать и равноденствия в течение предопределенного периода времени, прежде чем добавить 30 микролитров следующей самой высокой концентрации, пока не будет добавлено каждое последовательное разбавление агониста. Чтобы проанализировать данные, вычесть извечок последней точки данных перед первым добавлением агонистного решения и установить время добавления нуля для нормализации значений неуступаемности. Участок время курс нормализованного impedance, и построить отдельные курсы времени для выявления maxima в impedance после каждого шага добавления.
Составьте лист данных с этими значениями и сшипите значения изменения максимального импульса как функцию агонистической концентрации. Затем используйте режим установки данных для определения полу максимальных эффективных концентраций и максимальной реакции с помощью четырех параметров логистической модели. В этом репрезентативном эксперименте, 10 решений с увеличением концентрации гистамина были последовательно добавлены в клетки каждые 15 минут, и изменение в impedance измеряется в каждый момент времени.
Затем изменения в неуступляемом режиме можно было бы рассматривать как функцию концентрации гистамина и функцию переноса четырех параметров логистической модели, установленной на экспериментальные точки данных из семи скважин. Для учета возможных рецепторов гистамина downregulation, десенсибилизации клеток, или чрезмерной стимуляции, диапазон данных для анализа может быть уменьшена, как показано для этого одного серийного досирования эксперимента. Затем к данным можно применить трехка параметрами, обеспечивая полу максима эффективную концентрацию 0,75 плюс-минус 0,12 микромолара для этого анализа.
Добавление антагониста рецепторов гистамина димедрол за 20 минут до первого гистамина приводит к задержке увеличения неуступаемности в схеме серийного досирования, что соответствует необходимости более высокого агониста, чтобы вызвать реакцию клеток. В отношении реакции дозы эффект антагониста выражается как правый сдвиг кривых, соответствующий увеличению полу максимаальной эффективной концентрации, при условии, что антагонист является конкурентоспособным лигандом по отношению к агонисту. Успешное применение схемы серийного досирования технически просто, но требует продуманного планирования, так как выполнить все этапы с правильным временем сложно.
Серийная досирование проложила путь для проведения исследований реакции на концентрацию с другими системами считывания, которые ограничены в отношении числа образцов, контролируемых параллельно. Особые преимущества серийного дозирования позволяют изучать опосредованную рецепторами трансдукцию сигнала с совершенно новыми считываниями, чувствительными к другим фенотипическим изменениям, таким как цитомеханика. Пожалуйста, носите перчатки и очки при подготовке фондовых растворов агониста рецепторов, так как они могут быть опасны при вдыхании или проглатывании.
