このプロトコルは、カルシウム活性パターンを単一細胞レベルでの遺伝子発現と相関させるために使用することができ、研究者はこれらの2つの特徴の関係に関する新しい質問を調査する能力を与える。一般的に組織全体を研究する以前のアプローチとは対照的に、私たちの技術は単一細胞レベルにズームインし、カルシウム活性と遺伝子発現との細胞自律的関係を評価することを可能にします。35ミリメートルプラスチックペトリ皿2個と35ミリメートルの細胞培養皿1個を約30分間UV殺菌することから始めます。
層流フードで作業し、2つの50ミリリットルプラスチック円錐管、1つのUV滅菌ペトリ皿、およびUV滅菌された細胞培養皿のそれぞれに2ミリモルカルシウム溶液の10ミリリットルを加えます。他のUV殺菌されたペトリ皿にカルシウムとマグネシウムフリー溶液を2ミリリットル加え、100ミリメートルプラスチックペトリ皿2個と35ミリメートルプラスチックペトリ皿1本に0.1X MMRをゲンタマイシンで補います。その後、70%エタノールで60ミリメートルプラスチックペトリ皿を充填します。
解剖の直前に、0.01グラムのコラーゲンBをカルシウム溶液の1つのチューブに十分に混ぜます。新しい60ミリメートルプラスチックペトリ皿に溶液を追加し、目的の発達段階の胚を識別するために解剖顕微鏡を使用しています。滅菌移動ピペットを使用して、少なくとも6個の適切な胚をMMRプラスゲンタマイシンを含む1つの100ミリメートルプレートに移動させます。
次に、保持プレートから1つの胚をMMRプラスゲンタマイシンの2番目の100ミリメートルプレートに移動させ、この解剖プレートを顕微鏡の下に置きます。胚を安定させるために鈍い鉗子のペアを使用して、慎重に微細な鉗子のペアで胚を囲むビテリン膜を剥がします。すべての膜が取り除かれたら、細かい鉗子を使用して、後側および腹側領域を分離するために、前部後軸に沿って胚をつまむ。
新しい滅菌移動ピペットを使用して、背部部分をコラーゲン液の60ミリメートルプレートに1〜2分間転送してから、検体を慎重に解剖プレートに戻します。解剖を完了するには、外胚葉の推定神経組織から残存する内胚葉および中胚葉汚染をすべて慎重に除去し、外植物をカルシウム溶液の35ミリメートルプレートに穏やかに移す。さらに3つの外植植物が採取された場合は、P1000マイクロピペットを使用して、4つの外植物をすべて35ミリメートルのカルシウムおよびマグネシウムフリー溶液に移し、外植と空気水界面との接触を避けるように注意してください。
その後、プレートの中央にすべての外植物が集まり、組織が解体できるように室温で1時間サンプルをインキュベートするように皿をそっと渦巻きます。このインキュベーション中に、最後の2つの胚をゲンタマイシンでMMRの2番目の皿に移し、これらの標本が乱れなくなるのを可能にするために皿を覆う。インキュベーションの最後に、スーパー接着剤を使用して、35ミリメートルの細胞培養皿の底にマイクロルールドカバースリップを取り付け、P100マイクロピペットを使用して解約したエクスプラントを収集します。
ピペットを細胞培養皿の表面に近い浅い角度で保持し、ピペットチップを内側に向けたグリッドの隅に配置し、グリッド領域全体に細胞懸濁液をしっかりと排出します。理想的には、細胞は密な、密なクラスターに落ち着きます。細胞を室温で1時間プレートに付着させます。
細胞が沈降している間、兄弟制御胚の発達段階を決定し、記録する。インキュベーションの最後に、サンプル皿を光保護された場所に移動させ、皿の端から100マイクロリットルの溶液を吸引する。この溶液を、サンプル皿にフルボリュームを戻す前に、新たに調製したFluo-4 AM Pluronic F127酸溶液を上下ピペット処理して7マイクロリットルと混合します。
軽く旋回して、プレートをアルミニウムホイルで混ぜて覆います。室温で1時間後、外植培養皿上清の1ミリリットルをカルシウム溶液の新鮮な2ミリモルの3ミリリットルに置き換える。その後、上清の3ミリリットルを3ミリリットルの新鮮なカルシウム溶液でさらに2回交換します。
外植内のカルシウム活性イメージングの場合、サンプルプレートを周囲光暴露から保護された反転共焦点顕微鏡のステージに配置し、マーカーを使用してプレートの前点にラベルを付け、その後のイメージングセッションで同じ視野を見つけることができます。目的の 10 倍と 20 倍を使用して、顕微鏡下でサンプルを見つけ、セル密度は高いが、細胞が凝集しているか、個別に区別することが困難な適切な視野を選択します。グリッド罫線のカバースリップが見えるように顕微鏡の焦点を調整し、必要に応じて識別可能な数がフレームに入るまで元の視野を変更します。
グリッド罫線のカバースリップにフォーカスを設定し、選択した視野の明るい視野画像をフォーカスのある状態で、選択した視野の明るい視野画像を取得します。グリッド付きカバースリップと視野の明確な画像がないと、後で生成する魚の画像のセルを登録することはできません。その後、488ナノメートルのレーザーでサンプルを照らします。
2 時間のイメージの場合、イメージを取得するために構成を実行する前に、スキャン時間が 3.93 秒の 901 フレームを 8 秒の間隔で記録するようにイメージ構成を変更します。イメージングが完了したら、顕微鏡段階からプレートを取り出し、培養の開始時に兄弟対照胚の発達段階を記録するように注意して、室温で2時間培養するために1X MEMFAの1ミリリットルで培養上清を交換します。実験で記録されたすべての細胞の痕跡を含む複合プロットの視覚化により、バルクまたは母集団の測定値がスパイク動作のより微妙なパターンをどの程度隠すことができるかを明らかにします。
個々の細胞の記録されたプロファイルが単離されると、神経前駆細胞の不規則なスパイク活性特性の例が明確に同定され得る。この複雑さを定量化するために、さまざまなパラメータを含むさまざまなデータ分析方法を適用して、スパイクを定義できます。プレートが大まかに取り扱われる場合や、その場での蛍光化中に強引に行われる場合、細胞をプレート表面から外して、細胞が画像間で一致することが不可能になります。
この中断が視野の一部のセルにのみ影響する場合でも、画像内の一部のセルを検出して割り当てることは可能です。ただし、ハイブリダイゼーションを慎重に行い、画像間で失われたり再配置されたりする細胞が少ない実験から、データの最大量が得られます。神経前駆細胞マーカー遺伝子の発現とカルシウム活性を照合する実験の結果は、カルシウム活性と神経伝達物質表現型の特定のパターンとの間の多数の関連を明らかにすることができる。
このデータを使用すると、研究者は単純なスパイクカウントに制限されるのではなく、これらの動的カルシウムパターンのより複雑な特徴と遺伝子発現との関係を調査することができます。
