ゼブラフィッシュにおけるin situハイブリダイゼーション染色のジェノタイピングと定量化

遺伝子発現に対する突然変異の結果は、しばしばその際のハイブリダイゼーションによって定性的に評価され、一般的に視覚的に採点され、主観的であり、研究者の期待に偏っている。この方法は、画像の強度を定量化することで、situ実験でより一貫した比較方法を提供し、そのバイアスを除去します。また、遺伝子発現のリーダーとして、その遺伝子ハイブリダイゼーションに使用する他のモデルシステムにも容易に適応できます。

in in ハイブリダイゼーションまたはISH染色胚を画像化して開始する。グリセロール溶液を調製し、均質化するためにそれを混合します。3ミリリットルのパスツールピペットで胚をグリセロール溶液に移し、少なくとも5分間落ち着かせます。

イメージング後にISH染色胚を転写するのに十分なPCRチューブを準備し、ラベルを付け、3ミリリットルのパスツールピペットを使用して、ガラスうつ病スライドのウェルの底に100%グリセロールを追加します。単一のISH染色胚をガラススライドに移し、デジタルカメラと底部と上の照明を備えたステレオ顕微鏡の下に向けます。最初の胚を使用して、希望の倍率で照明と露光時間を調整します。

必要な数の胚を画像化し、各画像に一意の番号を付けます。イメージング後、各胚を同じ数で標識されたPCRチューブに移し、必要に応じてPCRチューブから余分なグリセロールを吸引します。DNAを抽出するには、HoTSHOTなどのアルカリ性リシスバッファーの40~75マイクロリットルを各チューブに加えます。

約30分間摂氏95度でチューブをインキュベートし、摂氏4度に冷却します。等量の中和バッファーを追加し、目的の変異のジェノタイピングを進めます。画像解析を実行するには、フィジーで画像を選択して開き、[編集] をクリックして[反転]をクリックし、[イメージ]タブをクリックして[タイプ]を選択し、[8ビット]を選択して、画像タイプを8ビットに変換します。

ポリゴン ツールを選択し、計測対象の ISH 信号を含む領域の周囲の画像に対象領域または ROI を手動で描画します。T キーを押して ROI マネージャを開き、対象地域を選択して、[測定] をクリックします。[結果] ウィンドウの平均値をスプレッドシートにコピーします。

背景の強度を測定するには、染色のない胚の領域に ROI を移動し、ROI マネージャで [追加] をクリックします。背景領域を選択して[メジャー]をクリックし、スプレッドシートに平均強度の値を記録します。NC2ハイブリダイゼーション信号の平均ピクセル強度を、染色領域の背景から背景の平均強度を差し引いて求める。

各サンプルの平均ピクセル強度を決定した後、各サンプルに遺伝子型を割り当てます。遺伝子型を特定できない場合は、そのサンプルを後続の分析から除外します。平均サンプル強度値を遺伝子型に基づいてソートし、統計検定を進めます。

この技術の有用性は、dnmt3bbのISHで実証されています。runx1ヘテロ接交インクロスからの胚の1。dnmt3bb の減少。

1発現は、ランx1ホモ接合変異体で検出され、ヘテロ接合性胚はdnmt3bbに有意な差を示さなかった。1 式。ランx1発現に対するlmo4突然変異の影響を判定しようとした場合、この分析は野生型とホモ接合lmo4変異体の発現に有意な差を示さなかった。

しかし、単一胚qPCRによりrunx1発現のわずかな減少が検出された。runx1-probed胚の約0.4%で、ISHは高いバックグラウンドを持ち、シグナルから差し引かれたときに負の数をもたらした。このような場合、胚は分析から除外された。

胚上の4つの異なる領域は、バックグラウンド補正を最適化するためにテストされています。背景領域のいずれでもROIの強度に比較的安定した差がありましたが、R3は常にROIよりも高い強度を示し、バックグラウンド補正には使用しないでください。R1 と R4 は、バックグラウンド補正に最も適した領域であることが判明しました。

イメージングに最適な条件を見つけ、実験全体を通してそれらを変更しないことが重要です。また、各サンプルに遺伝子型を割り当てる前に、ピクセルの強度を定量化することをお勧めします。