ハイパースペクトルイメージングにより、サンプル内の正確な位置で分光情報を取得できます。例えば、単結晶レベルでの光学異方性の発表に関してである。サンプルのスペクトルデータと空間データの両方の生成により、分光法または蛍光顕微鏡単独で可能なサンプルよりも詳細なサンプルの調査が可能になります。
解像度に影響を与える調整可能なパラメータの数が多い最初は圧倒的に見えるかもしれません。ただし、チェックリストを作成すると、システムに慣れるのに役立つ場合があります。この手法では、イメージ処理ハードウェアの手動調整とソフトウェア操作が必要です。
両方の方法が互いを補完する方法を示すために、両方の側面を視覚的に示することが不可欠です。ネルソン・ルタジョガとの手順を実証することは、私の研究室の博士研究員のエミリー・ロドリゲスです。ハイパースペクトルイメージングマッピング用のイメージャー構成を設定するには、顕微鏡ステージから始めて、検出器に向かって発光ビーム経路に従い、光学顕微鏡のすぐ隣に光学キューブの位置を空けて、可視光路を通してサンプルからの放出を導くその位置に共焦点顕微鏡光学立方体を配置します。
検出器に向かって光路に沿って見て、可視放出をその位置の検出経路に向けるために、二色性ミラーおよびフィルタを含む可視光キューブを配置する。検出器に向かって経路を続け、可視光検出経路を通して光を導く正しい位置に共焦点ピンホール光キューブを配置し、この経路に従って、放射された光が検出器に到達するように、光立方体を適切な位置に配置する。すべての立方体が配置されたら、選択したピンホールのサイズに合わせて検出器のスリット開口部を手動で調整します。
次に、PHySpec ソフトウェアで、ピンホールの絞りを選択します。単結晶のテルビウム・ユーロピウム・ビ・ピリミジン・トリフルオロアセチルアセトネートのハイパースペクトルイメージングマッピングの場合、光学顕微鏡の目的をサンプルの下に20倍配置し、顕微鏡の左側にある白いボタンを押して白色光を点灯させます。ボタンの下のノブを回して明るさを調整します。
マイクロスコープの右側にある前方ノブをRに設定し、信号の20%をカメラに送信し、80%の信号を検出器に送ります。PHySpec ソフトウェアのカラーカメラウィンドウで再生ボタンを押して、ライブスキャンを開始します。カラーカメラウィンドウに暗すぎる画像や黒色の画像が表示される場合は、カラーカメラタブの露出時間やゲイン値を増やします。
画像が明るすぎる場合は、露出時間やゲイン値を減らします。サンプルに焦点を合わせるには、顕微鏡のノブを回してステージ内の目的との距離を調整し、広帯域ランプシャッターを開けてサンプルの紫外線励起を可能にします。次に、強度ノブを希望の位置に回して、広帯域ランプ励起の強度を制御します。
スケール バーの表示/非表示をクリックして、クリスタルの明視野光学顕微鏡画像にスケール バーを追加し、UV フルまたは制限された照明下で結晶のイメージを観察します。閉じ込められた照明か広いフィールドの照明間で選択するには、スティックとノブを使用して、UVランプフィールドの絞りのサイズを調整します。SpectraPro SP 2300タブで、サンプルの放出を観察する波長を選択し、検出器の露光時間を調整します。
シーケンサーでハイパースペクトル キューブを取得するには、プラスをクリックして新しいノードを追加し、[共焦点イメージャー] をクリックします。[マルチスペクトル集録]をクリックし、希望のX位置とY位置カウント、および希望のステップサイズを入力します。カメラ同期と可視放出マッピングのハードウェアオプションを選択し、[大丈夫]をクリックします。
シーケンサーで、新しく追加されたマルチスペクトル集録線をクリックしてノードをハイライト表示し、[再生]をクリックして選択したノードを実行します。キャプチャしたハイパースペクトルイメージングデータの解析では、たとえば、画像のスペクトル分布の場合は、[処理]メニューで[データ]と[トリミングとベンド]を選択して、画像の信号対ノイズ比を増加させます。放出強度プロファイルの場合、キューブ イメージを右クリックし、1 行の分析に X プロファイルを作成を選択します。
ドラッグして領域を選択し、対象地域を右クリックします。[グラフに追加] を選択します。目標の物理的位置の関数として発光強度を表示する。
強度プロファイルが新しいグラフに表示されます。サンプルの特定の領域の放出スペクトルを取得するには、キューブ イメージの上にカーソルを置き、右クリックして[矩形選択]をクリックします。ドラッグしてクリックし、目的の領域に選択範囲の形状を描画します。
次に、対象の領域を右クリックし、[グラフに選択を追加]を選択します。[グラフに追加]ウィンドウで、[新しいグラフを作成]を選択してターゲットの放出スペクトルを表示し、[大丈夫]をクリックします。次に、新しい領域を選択する前に、取得したスペクトルを保存します。
ここでは、適切な焦点で試料を調整した後に記録された結晶の明視野画像が示されている。結晶の針状の形態は、はっきりと観察することができる。ここでは、UV励起下の同じ結晶の画像が完全な照明または局所的に閉じ込められた照明のいずれかで観察することができる。
閉じ込められた照明は、波導路のような挙動を引き起こす可能性のある結晶内のエネルギーまたは光の伝達の影響を調べるのに使用することができる。例えば、この画像では、励起の直下でない点で強い発光が検出され、結晶を通して効率的なエネルギー移動が行われることを示唆している。取得したハイパースペクトルキューブから、特定の波長を表す画像の形でスペクトル分布を得ることができる。
特定の発光波長の強度プロファイルと、取得したハイパースペクトルキューブの任意の画素または領域における発光スペクトル。例えば、この分析の発光スペクトルは、ユーロピウムイオンの最も特徴的な放出バンドを示しています。さらに、異なる結晶面に沿った空間プロファイルは、先端面と側面で明るい発光を示し、3つの空間方向におけるランタニド/ランタニドイオン距離と相関させることができる。
ハイパースペクトルキューブの妥当な記録時間で良好な信号を得るためには、顕微鏡の構成、焦点、および検出器の露光時間を調整することが重要です。UV励起および可視発光の排出は、近赤外線励起および近赤外発光検出を用いて行うことができる。これにより、大量の発光材料に適用できます。
光学信号とさまざまな依存的特徴の相関は、ナノバイオ相互作用のインビトロ評価を含む構造/特性関係の調査にとって非常に興味深い技術です。
