A imagem hiperespectral permite a aquisição de informações espectroscópicas em locais precisos dentro de uma amostra. Por exemplo, para a revelação de anisotropia óptica em um único nível de cristal. A geração de dados espectrais e espaciais de uma amostra permite uma investigação mais detalhada da amostra do que é possível apenas por espectroscopia ou microscopia de fluorescência.
Um grande número de parâmetros ajustáveis que afetam a resolução pode parecer esmagador no início. No entanto, fazer uma lista de verificação pode ajudar a se familiarizar com o sistema. Esta técnica requer ajuste manual do hardware de imagem, bem como manipulação de software.
É essencial ilustrar ambos os aspectos visualmente para mostrar como ambos os métodos se complementam. Demonstrando o procedimento com Nelson Rutajoga estará Emily Rodrigues, bolsista de pós-doutorado do meu laboratório. Para configurar a configuração do imager para mapeamento de imagens hiperespectrais, partindo do estágio do microscópio e seguindo a via do feixe de emissão em direção aos detectores, deixe a posição para um cubo óptico ao lado do microscópio óptico vago e coloque o cubo óptico do microscópio confocal nessa posição que direciona a emissão da amostra através do caminho da luz visível.
Olhando ao longo do caminho óptico em direção ao detector, coloque o cubo óptico visível contendo o espelho dicroico e filtros para direcionar a emissão visível para o caminho de detecção em sua posição. Continuando o caminho em direção ao detector, coloque o cubo óptico confocal pinhole na posição certa para direcionar a luz através do caminho de detecção de luz visível e seguindo esse caminho, coloque o cubo óptico do espectrômetro confocal na posição apropriada para que a luz emitida chegue ao detector. Quando todos os cubos estiverem no lugar, ajuste manualmente a abertura da fenda do detector para combinar com o tamanho do orifício selecionado.
Em seguida, no software PHySpec, selecione a abertura do pinhole. Para mapeamento de imagens hiperespectrais do trifluoroacetilado trifluoroacetiladotonato de trifluoroacetilação de terbium, posicione manualmente o objetivo de 20 vezes do microscópio óptico sob a amostra e pressione o botão branco no lado esquerdo do microscópio para acender a luz branca. Gire o botão sob o botão para ajustar o brilho.
Defina o botão dianteiro no lado direito do microscópio para R para enviar 20% do sinal para a câmera e 80% do sinal para o detector. Pressione play na janela da câmera colorida no software PHySpec para iniciar uma varredura ao vivo. Se a janela da câmera colorida mostrar uma imagem muito escura ou preta, aumente o tempo de exposição e/ou o valor de ganho sob a aba da câmera colorida.
Se a imagem estiver muito brilhante, diminua o tempo de exposição e/ou ganhe valor. Para focar na amostra, gire os botões do microscópio para ajustar a distância entre o objetivo no estágio e abrir o obturador de lâmpada de banda larga para permitir a excitação UV da amostra. Em seguida, gire o botão de intensidade para a posição desejada para controlar a intensidade da excitação da lâmpada de banda larga.
Clique na barra de escala Show/Hide para adicionar uma barra de escala à imagem de microscopia óptica de campo brilhante do cristal e observar uma imagem do cristal sob iluminação completa ou confinada. Para selecionar entre a iluminação confinada ou uma iluminação de campo amplo, use a vara e os botões para ajustar o tamanho da abertura do campo da lâmpada UV. Sob a guia SpectraPro SP 2300, selecione um comprimento de onda para observar a emissão da amostra e ajuste o tempo de exposição do detector.
Para obter o cubo hiperespectral no sequenciador, clique em adicionar um novo nó e clique em Confocal Imager. Clique em Aquisição multi-espectro e insira as contagens desejadas de posição X e Y, bem como o tamanho da etapa desejada. Selecione a opção de hardware para a sincronização da câmera e para mapeamento de emissões visíveis e clique em ok.
No sequenciador, clique na linha de aquisição de vários espectros recém-adicionada para destacar o nó e clique em Reproduzir para executar o nó selecionado. Para análise dos dados de imagem hiperespectral capturados, por exemplo, para uma distribuição espectral de uma imagem, no menu Processamento, selecione Dados e Crop e Bend para aumentar a relação sinal/ruído da imagem. Para obter um perfil de intensidade de emissão, clique com o botão direito do mouse na imagem do cubo e selecione Criar Perfil X para a análise de uma linha.
Arraste para selecionar a área e clique com o botão direito do mouse na região de interesse. Para selecionar Adicionar ao gráfico. Para exibir a intensidade de emissão em função da posição física do alvo.
O perfil de intensidade aparecerá no novo gráfico. Para obter um espectro de emissão de uma área específica da amostra, passe o cursor sobre a imagem do cubo, clique com o botão direito do mouse e clique em Seleção de Retângulo. Arraste e clique para desenhar a forma de seleção sobre a região desejada.
Em seguida, clique com o botão direito do mouse na região de interesse e selecione Adicionar seleção ao gráfico. Na janela Adicionar ao Gráfico, selecione Criar um novo gráfico para exibir o espectro de emissão do alvo e clique em ok. Em seguida, salve o espectro adquirido antes de selecionar uma nova região.
Aqui, uma imagem de campo brilhante de um cristal registrado após ajustar a amostra no foco adequado é mostrada. A morfologia semelhante à agulha do cristal pode ser claramente observada. Aqui, podem ser observadas imagens do mesmo cristal sob excitação UV com iluminação total ou iluminação localmente confinada.
A iluminação confinada pode ser usada para investigar os efeitos da transferência de energia ou luz dentro do cristal que pode desencadear um comportamento semelhante a guia de ondas. Por exemplo, nesta imagem, uma forte emissão é detectada em um ponto não diretamente sob excitação, sugerindo que a migração eficiente de energia ocorre através do cristal. A partir do cubo hiperespectral adquirido, também é possível obter a distribuição espectral na forma de uma imagem, representando um comprimento de onda específico.
O perfil de intensidade de um comprimento de onda de emissão específico e o espectro de emissões em qualquer pixel ou área do cubo hiperespectral adquirido. Por exemplo, o espectro de emissões para esta análise mostra as faixas de emissão mais características do íon europium. Além disso, o perfil espacial ao longo das diferentes faces cristalinas indica uma emissão mais brilhante na ponta e nas faces laterais e pode ser correlacionado com as distâncias de íons de lantano/lantano nas três direções espaciais.
Para obter um bom sinal em um tempo razoável de gravação do cubo hiperespectral, é importante ajustar as configurações do microscópio, o foco e o tempo de exposição do detector. Excitação UV e emissão visível, essa técnica pode ser realizada usando excitação infravermelha próxima e detecção de emissões infravermelhas próximas. Isso permite que seja aplicável para uma grande variedade de materiais luminescentes.
A correlação de sinais ópticos com uma série de características dependentes torna essa técnica muito interessante para a investigação de relações estruturais/propriedades, incluindo avaliação in vitro de interações nano-bio.
