Гиперспектральная визуализация позволяет получать спектроскопическую информацию в точных местах в образце. Например, для открытия оптической анисотропии на одном кристаллическом уровне. Генерация как спектральных, так и пространственных данных образца позволяет провести более детальное исследование образца, чем это возможно только с помощью спектроскопии или микроскопии флуоресценции.
Большое количество регулируемых параметров, влияющих на разрешение, на первый взгляд может показаться подавляющим. Тем не менее, составление контрольного списка может помочь с ознакомомомомся с системой. Этот метод требует ручной настройки оборудования для визуализации, а также манипуляций с программным обеспечением.
Важно проиллюстрировать оба аспекта визуально, чтобы продемонстрировать, как оба метода дополняют друг друга. Демонстрацией процедуры с Нельсоном Рутайогой будет Эмили Родригес, докторант моей лаборатории. Чтобы настроить конфигурацию изображения для гиперспектрального картирования изображений, начиная со стадии микроскопа и следуя пути пучка излучения к детекторам, оставьте положение для оптического куба прямо рядом с оптическим микроскопом вакантным и поместите конвекальный оптический микроскоп куб в том положении, которое направляет излучение от образца через видимый световой путь.
Глядя по оптическому пути к детектору, поместите видимый оптический куб, содержащий дихроическое зеркало, и фильтры для направления видимого излучения на путь обнаружения в его положении. Продолжая путь к детектору, поместите конфокальный пинхол оптический куб в нужное положение, чтобы направить свет через видимый путь обнаружения света и следуя по этому пути, поместите конфокальный спектрометр оптического куба в соответствующее положение, так что испускаемый свет достигает детектора. Когда все кубы находятся на месте, вручную отрегулируйте отверстие щели детектора, чтобы соответствовать размеру выбранной пинхолы.
Затем, в программном обеспечении PHySpec, выберите диафрагму пинхол. Для гиперспектральной визуализации отображения тербия европия би-пиримидина трифтороацетилацетонат одного кристалла, вручную распоить 20 раз цель оптического микроскопа под образцом и нажмите белую кнопку на левой стороне микроскопа, чтобы включить белый свет. Поверните ручку под кнопку, чтобы настроить яркость.
Установите перемотку вперед на правой стороне микроскопа на R, чтобы отправить 20% сигнала на камеру и 80% сигнала на детектор. Нажмите играть в окне цветной камеры в PHySpec программного обеспечения, чтобы инициировать живое сканирование. Если окно цветной камеры показывает слишком темное или черное изображение, увеличьте время экспозиции и/или значение усиления под вкладкой цветной камеры.
Если изображение слишком яркое, уменьшите время экспозиции и/или получите значение. Чтобы сосредоточиться на образце, поверните ручки микроскопа, чтобы настроить расстояние между целью в стадии и открыть широкополосный затвор лампы, чтобы УФ возбуждение образца. Затем поверните ручку интенсивности в нужное положение, чтобы контролировать интенсивность возбуждения широкополосной лампы.
Нажмите Show/Hide масштабную планку, чтобы добавить планку масштаба к ярко-полевому оптическому микроскопии изображения кристалла и наблюдать изображение кристалла под УФ полным или ограниченным освещением. Чтобы выбрать между ограниченным освещением или широким освещением поля, используйте палку и ручки, чтобы настроить размер диафрагмы поля УФ-лампы. Под вкладкой SpectraPro SP 2300 выберите длину волны для наблюдения за выбросами образца и корректировки времени экспозиции детектора.
Чтобы получить гиперспектральный куб в секвенсоре, нажмите плюс, чтобы добавить новый узел и нажмите Confocal Imager. Нажмите Multi-Spectrum Acquisition и вввьйте желаемое значение позиции X и Y, а также желаемый размер шага. Выберите аппаратный параметр для синхронизации камеры и для видимого отображения выбросов и нажмите кнопку «Хорошо».
В секвенсоре щелкните недавно добавленную линию приобретения нескольких спектров, чтобы выделить узел, и нажмите Кнопку Play, чтобы запустить выбранный узел. Для анализа захваченных данных гиперспектральной визуализации, например, для спектрального распределения изображения, в меню обработки, выберите Data and Crop и Bend для увеличения соотношения сигнала к шуму изображения. Для профиля интенсивности выбросов нажмите правой кнопкой мыши на изображение куба и выберите Create X-Profile для анализа одной строки.
Перетащите, чтобы выбрать область и право нажмите на область интересов. Чтобы выбрать Добавить в график. Отображение интенсивности выбросов в качестве функции физического положения цели.
Профиль интенсивности появится на новом графике. Чтобы получить спектр выбросов определенной области образца, наведите курсор на изображение куба, нажмите правой кнопкой мыши и нажмите Rectangle Selection. Перетащите и нажмите кнопку, чтобы нарисовать форму выбора над желаемой областью.
Затем нажмите правой кнопкой мыши на область интереса и выберите Add Selection to Graph. В окне Add to Graph выберите Создайте новый график для отображения спектра выбросов цели и нажмите кнопку «Хорошо». Затем сохраните приобретенный спектр, прежде чем выбрать новый регион.
Здесь показано ярко-полевое изображение кристалла, записанное после регулировки образца в правильном фокусе. Игольчатая морфология кристалла хорошо наблюдается. Здесь можно наблюдать изображения одного и того же кристалла под ультрафиолетовым возбуждением с полным освещением или локально ограниченным освещением.
Ограниченное освещение может быть использовано для исследования воздействия энергии или передачи света в кристалле, что может вызвать волновое поведение. Например, на этом изображении сильное излучение обнаруживается в точке, не непосредственно под возбуждением, что свидетельствует о том, что эффективная миграция энергии происходит через кристалл. Из приобретенного гиперспектрального куба также можно получить спектральное распределение в виде изображения, представляющего определенную длину волны.
Профиль интенсивности определенной длины волны излучения и спектры излучения в любом пикселе или области приобретенного гиперспектрального куба. Например, спектры выбросов для этого анализа показывают наиболее характерные диапазоны выбросов иона европия. Кроме того, пространственный профиль вдоль различных кристаллических лиц указывает на более яркое излучение на кончике и боковых лицах и может быть коррелирован с ионными расстояниями лантанида/лантанаида в трех пространственных направлениях.
Чтобы получить хороший сигнал в разумные сроки записи гиперспектрального куба, важно настроить конфигурации микроскопа, фокус и время экспозиции детектора. Выбросы УФ возбуждения и видимых выбросов, этот метод может быть выполнен с помощью ближнего инфракрасного возбуждения и ближнего инфракрасного обнаружения выбросов. Это позволяет применять его для большого массива люминесцентных материалов.
Корреляция оптических сигналов с массивом зависимых функций делает этот метод очень интересным для исследования структуры/имущественных отношений, включая витро оценку нано-био взаимодействий.
