磁気ナノ粒子は、磁気特性が強く、表面の機能化が容易なため、分析科学やナノ医薬品に最適なツールです。ここでは、アミノ機能化シリカ磁性粒子とシドロフォアフェロキサミンとの間のコンジュゲートの最初のインスタンスを、フォトジェニック材料の捕捉評価と共に報告する。シドロフォアは、鉄のパタケ機構において重要な役割を果たす小さな有機分子であり、細菌の特定の外膜受容体によって認識されています。
このビデオは、ステップバイステップで、磁気鉄ナノ粒子を調製するための効率的なプロトコルを表示します。次いで、分散液を保護し、磁気核を保護するためにシリカでコーティングしました。得られた反応器表面をアミン基で機能させた。
フェロキサミンと共役した磁性ナノ粒子の合成20 mLガラスバイアルに0.5グラムのFe(acac)3を加えます。その後、10mLのベンジルアルコールと混ぜます。
この混合物を2分間超音波処理します。その後、加熱ブロックに移し、摂氏180度で72時間加熱します。ナノ粒子を96%エタノールでリンスします。
そして30分間遠心分離機。ネオジム磁石を用いて、磁力により上清からナノ粒子を分離する。残留溶媒を捨てる。
溶剤が透明に見えるまで、超音波処理と交互に上清を捨てます。80ミリリットルのイソプロパノールで2グラムのMNPの懸濁液を調製し、4ミリリットルの21%アンモニア、7.5ミリリットルの蒸留水、および0.56ミリリットルのTEOSを加える。混合物を摂氏40度で2時間加熱し、連続攪拌します。
その後、1時間超音波処理します。MNPを磁石で分離し、上澄み物を捨て、イソプロパノールの30ミリリットルに分散し、アンモニア、蒸留水、およびTEOSを、前述の順序と同じ順序で添加する。連続攪拌で2時間40度の摂氏で混合物を加熱します。
その後、1時間超音波処理します。磁気スターバーを取り外して便利に洗い、すべての材料を回収します。上清を捨て、96%エタノールでナノ粒子を3回すすいで、超音波処理と交互に。
室温でナノ粒子を真空下で12時間乾燥させます。ジメチルホルムアミドを用いて前工程から得られたMNP@SIO2の500ミリグラムをリンスする。それらを超音波処理し、破棄します。
丸底フラスコで粒子を再懸濁し、磁気バーでかき混ぜ、9ミリリットルのAPTESを加えます。60度で12時間かき混ぜます。上清を捨て、96%エタノールでナノ粒子を3回すすいで、超音波処理と交互に。
100mgのデフェキサミン、メシル酸塩、53.0ミリグラムの鉄アセチルアセトネートを5ミリリットルの蒸留水に溶解します。混合物を室温で一晩かき混ぜます。得られた生成物を分離漏斗で20ミリリットルの酢酸エチルで3回洗浄する。
真空下で有機溶剤を除去します。水相を凍結乾燥させて、フェロキサミンと赤い固体を与えます。50ミリリットルの丸底フラスコで5ミリリットルのピリジンで100mgのフェロキサミンの溶液に350ミリグラムのコハク酸無水物を加える。
得られた混合物を室温で16時間かき混ぜる。減圧下で過剰のピリジンを除去する。反応粗物を3ミリリットルのメタノールに溶かします。
メタノール溶液をLH-20カラムに移し、0.5 mL/分で溶出します。赤い分画を収集し、真空下でメタノールを除去します。乾燥アミンの30mgをDMFで2回、ナノ粒子を100ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコで30分間超音波処理する。
200ミリグラムN-スクシニルフェロキサミンの溶液を準備し、 173 ミリグラム ベンゾトリアゾール 1-yl-オキシトリスホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩 BOP, 46 mg 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール HOBt および 128.8 ミリグラム N, N-ジイソプロピレチルアミン DIPEA, DMF 10 mL, 50 ミリリットルラウンドボトムフラスコス.乾燥した酸素のない状態で超音波処理の下で、DMFの3ミリリットルで、以前にすすったMNP@SiO2@NH2を中断します。アルゴン雰囲気を使用してください。
加えます, ドロップワイズ, Bを混合 B.シェイク最終混合物, 軌道シェーカーを使用して, 室温で一晩.得られたコンジュゲートを磁石を用いて懸濁液から分離する。Y.エンゴコリチカ株による細菌アッセイは、ナノ粒子を含む病原性細菌の単離および捕獲を定量化する。
滅菌チューブ内の1mg /mLですべての中間ナノ粒子と最終コンジュゲートをPBSに調製します。ルリアベルタニ、LB、スープの5 mLでY.entorocoliticaの文化を一晩準備します。鉄欠乏性の5 mLのトリプケース大豆ブロス、TSB、10 mM 2、2-ビピリジル溶液の50マイクロリットルを添加して調製します。
Y.エンゴコリチカの一晩培養物の50マイクロリットルで5ミリリットルの鉄欠乏性TSBブロスを接種する。0.5~0.8のOD600に達するまで、攪拌で37度のインキュベート。一晩培養した100マイクロリットルを取り、900マイクロリットルのPBSを含むチューブで希釈し、最初の1/10希釈液を得る。
次いで、同じ手順を用いて最初の希釈から1/100希釈を調製し、10で細菌細胞の濃度を得て、ミリリットル当たり6コロニー形成単位の電力を得た。1/100細菌希釈液の1ミリリットルに100マイクロリットルのナノ粒子懸濁液と1mg/mLを加えます。MNP菌凝集体を分離し、磁石を用いて、廃棄し、慎重に、上清を廃棄する。
分離したナノ粒子を1ミリPBSで2回、渦を使用してリンスする。前の懸濁液から4つの連続した1/10希釈液を準備し、マイナス4希釈の力に10を供給する。TS寒天プレートに各希釈液の10マイクロリットルをプレート。
エピホワイトモードでゲルデジタイザーでプレートを撮影します。画像を処理し、便利なソフトウェアを使用して、個々のコロニーの数をカウントするスポットを増幅する。ナノ粒子とシドロフォアとの共有結合の形成を確認するために、我々は、各ステップで新しい官能基と一致して新しいバンドがどのように出現するかを観察し、合成を監視するためにFT-IRラマン分光法を採用しています。
TEMおよびSEM顕微鏡を用いて、形態および粒子サイズを観察した。熱重量分析は、有機材料の添加による重量損失を測定する。そして、XPSは、表面の原子の異なる酸化状態を分析し、共有結合の形成を確認することを可能にします。
最後に、最終的なコンジュゲート上のすべての中間体を使用して、細菌を捕捉する能力をテストし、バイオセンサーとしての特性を確立しました。このプロトコルは、マグネタイトナノ粒子の高い生体適合性を利用するように設計されました。シリカによるコーティングは、分散を改善し、水性媒体の劣化から磁気核を保護します。
また、カルボディイミド化学によって酸修飾シデロフォアを共有結合するために必要なアミン基と機能化する反応性表面を与える。この場合、N-スクシニルフェロキサミン。コンジュゲート細菌捕獲能力を試験し、その結果、PBS細菌懸濁液に提示されたかさばる効果に関する特定の相互作用のために中間体と有意な差を与えることなく、少数のコロニーが見つかった。
