磁気ナノ粒子の合成や磁気測定を用いた、生物環境の変化を撮影するための高速かつ効率的な方法を紹介します。磁気ナノ粒子は、生物医学の応用のために注目を集めています, そして、それは細胞内で一度内在化した運命を理解することが重要です.これは、セルラー磁気を測定することによって、ここで達成されます。
磁気ナノ粒子の合成と測定の両方で、結果は汚染の影響を受ける可能性があります。よく洗浄された化学バイアルを使用し、磁力計装置が汚染のないようにしてください。磁気測定サンプルホルダーは、通常、粉末サンプルに使用されます。
ホルダーの使用を液体または生物学的サンプルに適合させる方法を示す。30ミリリットルマナ波ガラスバイアルでは、ベンジルアルコールの10ミリリットルに鉄3アセチルアセトネートの400ミリグラムを溶解します。マイクロ波反応器を使用して、1分間に摂氏11.25度の速度で摂氏25度から250度まで懸濁液を加熱し、摂氏250度に保ちます。
ナノ粒子を分離するには、ネオジム磁石を30分間塗布します。ナノ粒子をペレット化するには、指定された洗浄液の10ミリリットルを用いて一連の洗浄を行い、ネオジム磁石を5分間塗布する。濾液を取り除き、10の12ミリリットルをマイナス2モル塩酸に加えます。
懸濁液を100キロダルトンフィルターと2、200回Gで10分間遠心分離する。その後、ナノ粒子を10ミリリットルの10ミリリットルからマイナス2モル塩酸に再懸濁させる。原稿に記載されているとおりにコーティング分子溶液を調製する。
コーティング分子とナノ粒子との間に5対1の質量比で10ミリリットルナノ粒子水分散液をコーティング分子溶液に加えます。次いで、磁気攪拌機を使用して室温で2時間混合物を攪拌します。反応が完了したら、1モルの水酸化ナトリウムを用いて混合物のpHを7に調整する。
ヒト間葉系幹細胞の培養が5%と90%コンフルエントの経過にある場合、培地を取り除き、グルタミンを含まない無血清RPMIで細胞をすすい洗う。各150平方センチメートルの培養フラスコに、ナノ粒子懸濁液の10ミリリットルを加える。フラスコを摂氏37度、炭酸ガス5%で30分間インキュベートします。
次にナノ粒子懸濁液を含む培地を廃棄し、細胞を無血清RPMI 1640で1回洗浄する。10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを添加したDMEMを追加します。一晩摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートし、ナノ粒子の完全な内部化を可能にします。
磁気標識されたMSCの各フラスコに摂氏37度を予感させた0.05%トリプシンEDTAの10ミリリットルを加えます。2〜3分後、細胞が剥離されると、すぐに事前に警告された補足DMEMの体積の3分の1を加えることによってトリプシンを不活性化する。260倍Gで5分間分離した細胞を遠心分離する。
培地を吸引し、50マイクロリットル当たり約200,000個の細胞濃度で少量の細胞スフェロイド培地中の細胞を再懸濁する。15ミリリットルの無菌の円錐形遠心分離チューブに作りたての細胞スフェロイド培地を1ミリリットル加えます。その後、200,000個の細胞に相当する細胞懸濁液の体積を加える。
これらの磁気標識細胞を180倍Gで3分間遠心分離し、チューブの底部に細胞ペレットを形成した。その後、チューブを摂氏37度、炭酸ガス5%に入れ、キャップをガス交換のためにわずかに開いたままにします。特定の体積の磁気ナノ粒子または固定単一セル回転楕円ストールを、振動サンプル磁力計(VSM)サンプルホルダーに入れます。
必要に応じて、PTFEテープを使用して漏れを防ぐことができます。サンプルホルダーを VSM に挿入し、サンプルオフセットをスキャンします。サンプルを最大磁化に対応する位置に配置します。
負の1,500エルステッドと正の1,500のエルステッドの間の低磁場で最初の測定を1秒あたり20のエルステッドの速度で行います。ゼロエルステッドと正の30,000エルステッドの間の高磁場で毎秒200のエルステッドの速度で2回目の測定を行います。水溶液中に分散したナノ粒子の10マイクロリットルを、振動試料磁力計で測定した。
曲線の第2の部分の傾きは、水とサンプルホルダーからの対磁性信号を表す、対磁性定数である。この対磁性定数は、溶液の磁気モーメントから差し引き、ナノ粒子の磁気モーメントのみを得た。その後、飽和時の磁気モーメントが決定されました。
コーティングされたナノ粒子を幹細胞に内在化した。電子顕微鏡画像は、エンドーソームに閉じ込められたクエン酸被覆ナノ粒子とPAAコーティングナノ粒子を示す。遠心分離によって細胞をペレット化した後、長期間培養中に保つことができる細胞スフェロイドを形成した。
個々の細胞回転楕円体もVSMを用いて測定し、飽和磁気モーメントを使用して細胞サンプル中のナノ粒子の量を計算した。ナノ粒子の取り込みは、そのインキュベーション濃度に依存することが判明した。時間の経過に伴う細胞回転楕円体の磁性の低下は、ナノ粒子の生分解を示し、これは電子顕微鏡で確認された。
分解は、PAAコーティングされたナノ粒子よりもクエン酸被覆ナノ粒子においてより実質的であった。磁気測定を用いることにより、細胞内の磁性ナノ粒子の分解を正確に定量化することができ、ナノ粒子の将来が生の挙動に関心を持つ場合の影響を評価することができます。このプロトコルでは、磁気測定測定は細胞回転楕円体で行われましたが、細胞を懸濁液または臓器に拡張することができます。
説明した方法を使用すると、興味のある異なる細胞系で新しく設計された磁気ナノ粒子の相互作用を探索することができますが、生体内の生体分布と運命に従うこともできます。
