このショウジョウバエ傷害プロトコルの全体的な目標は、軸索およびシナプス形態の保存、ならびに軸索とそのシナプスのシナプス機能の両方を観察することです。これらのアッセイは、ニューロンの維持因子の特徴付け、軸索輸送の研究、または無傷の軸索での軸索オルガネラの分析にも使用できます。部分的な翼傷害アッセイは、ショウジョウバエ翼の同じ神経束内の損傷のないコントロール軸索と並んで変性を受けている負傷した軸索の観察を可能にする。
この傷害アッセイは、マイクロハサミで翼の真ん中に大まかに切り傷を加えることで、野生型ハエで事前に容易に練習することができます。内部損傷は、軸索形態の評価を可能にし、光遺伝学を使用して軸索とそのシナプスの機能的保存を可視化する。アンテナアブレーションは安定した手を必要とします。
また、あらかじめ野生型ハエでアンテナを取り外す練習をすることをお勧めします。中毒では、利用可能な光遺伝学のセットアップは、帽子で飛んでニューロンを活性化するのに適しています。それ以外の場合は、簡単なセットアップを簡単にゼロから構築できます。
まず、5人の処女女性と右遺伝子型の5人の男性を使用して、室温で十字架を行います。P0世代を3~4日ごとに新しいバイアルに移します。新しいバイアルに毎日閉鎖されたばかりの大人の子孫F1世代を収集し、7〜14日間それらを老化させる。
麻酔後、マイクロハサミを使用して、翼の真ん中で大まかに内部翼静脈を切断します。怪我のために1つの翼を使用し、他の翼を年齢として使用して、怪我のないコントロールに一致しました。翼ごとに1つの怪我を適用し、15の翼を負傷させる必要があります。
バイアルを含む食品でハエを回復します。次に、ピペットを用いて、10マイクロリットルのハロカーボンオイル27を全体のガラススライドに沿って広げる。怪我の後1〜7日、マイクロハサミを使用して負傷者だけでなく、怪我をしていないコントロールウィングを遮断します。
ピンセットを使用して、中央の翼をつかみ、最大4つの翼をハロカーボンオイル27に取り付け、カバースライドで覆う。翼のGFP標識ニューロンの画像は、回転円盤で容易に取得することができる。しかし、購入時間は、皿が固定されていないため、翼を取り付けてから8分以内に行う必要があります。
回転ディスク顕微鏡を使用して、すぐに翼をイメージします。Z軸に沿った一連の光セクションを0.33マイクロメートルのステップサイズで取得し、Zスタックを1つのファイルに圧縮して、その後の解析を行います。5人の処女女性と右の遺伝子型から5人の男性を渡り、以前のようにF1世代を収集します。
麻酔の後、ピンセットを使用して、一方的なアブレーションのために右の第3のアンテナセグメントを、または両側アブレーションのための左右の第3のアンテナセグメントの両方を鈍化させる。これは、軸索突起がCNSに残っている間、GFP標識された神経細胞体を除去する。この技術で使用されるGFP標識ニューロンに応じて、細胞体が3番目に収容されているか、その後の傷害アッセイのために第2のアンテナセグメントに収容されているかを知ることが重要です。
バイアルを含む食品でハエを回復します。麻酔の後、ピンセットを使って首をつかみ、別のピンセットを使って胸郭を固定します。首をそっと引っ張り、胸郭から頭を離します。
固定溶液に浸したピンセットを使用して、4%パラホルムアルデヒドと0.1トリトンX100の固定溶液1ミリリットルを含む1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにすべてのヘッドをPBSで移します。室温で穏やかな攪拌で20分間頭を固定します。その後、氷の上にマイクロ遠心チューブを置き、ヘッドはマイクロ遠心チューブの底に引き寄せられます。
ピペットで上清を取り出し、PBSに0.1%トリトンX100を含む洗浄バッファーの1ミリリットルを追加します。チューブを室温で回転ホイールに置き、2分間洗浄します。さらに4回洗浄を繰り返して残留固定溶液を除去します。
脳を準備した後、カバースライドを取得し、その上にラボテープを貼り付け、テープからTのような形を切り取ります。チップの開口部を広げるために、チップの3ミリメートルが切断されている20〜200マイクロリットルのピペットチップを使用してください。スライド上に抗フェード試薬を含む脳をピペットし、カバースライドで脳を覆います。
粘土を使用して、2つの小さな偶数ロールを準備します。粘土ロールがガラススライドの高さより高くないことを確認します。粘土ロールをガラススライドに貼り付け、カバースライドサンドイッチを含む脳を粘土ロールの上に置きます。
原稿に従って進みます。光遺伝学のためにハエを準備するには、最初に電子レンジで食べ物を溶かします。食品が冷めた後、固化する前に、エタノール中のすべてのトランスレティナルを200ミクロモルの最終濃度に加えます。
よく混ぜて、すぐに空のバイアルに食べ物を注ぎます。固化食品を含むバイアルをプラグまたはコットンボールで覆います。バイアルをアルミホイルで包みます。
次に、バイアルを含む食品を暗い冷たい部屋に保管します。5人の処女女性と右遺伝子型の5人の男性を使用して、室温で十字架を行い、フライフードに200マイクロモルオールトランスレチナルを含むアルミニウム覆われたバイアルで以前のようにF1世代を収集します。次に、バイアルを含む食品からハエをタップして、食べ物のない空のバイアルにハエを収集します。
バイアルを氷に入れた氷で約30秒間冷やします。ハエは眠りに落ちる。今、急速に個々のハエを小さな部屋に入れて、光遺伝学を行うためにカバースライドを覆いました。
暗い部屋では、赤い光が存在しない30秒からなるプロトコルを実行し、その後10ヘルツで10秒間の赤色光暴露を行います。合計でこの手順を 3 回繰り返し、赤信号が表示されていない場合はさらに 30 秒間隔を続けます。二酸化炭素パッド上の各チャンバーから個々のハエを収集します。
アンテナ損傷を受けるには、左右の第2アンテナセグメントの両方をアブラテーションします。これは、軸索突起がCNSに残っている間、ジョンストンの臓器ニューロンの細胞体を除去する。200ミリモルオールトランスレチナルを含むアルミニウム覆われたバイアルでハエを回収します。
対応する時点で、例えば7日間のポストアンテナアブレーションで、ハエを別のグルーミングアッセイに供する。このプロトコルでは、切断された軸索とそのシナプスの形態と機能を研究するための3つの方法が提示された。第1の方法は末梢神経系の個々の軸索の高分解能観察を可能にする。
翼に野生型およびハイワイヤークローンを生成するための回路図の交差を以下に示します。負傷したGFP標識軸索のコントロールには、切断された軸索を示す矢印も表示されます。脳内のGFP標識感覚ニューロン軸索の軸索死を研究する第2のアプローチが提示される。
脳内の野生型およびハイワイヤークローンを生成するための模式的な十字架がここに示されている。負傷したGFP標識軸索における制御の例は、切断された軸索束を示す矢印を提示する。第3の方法は、軸索およびシナプス関数を奇抜化後に可視化するアプローチを示す。
模式的な交差は、野生型を生成し、ジョンストンの臓器感覚ニューロンを過剰に発現するnmnatを生成するためにここに示されています。野生型ハエは、アキソン死を減衰させたジョンストンの臓器ニューロンを含むハエです。両方とも怪我の前に強力なグルーミング行動を抱いていました。
しかし、怪我の7日後、グルーミングは野生型ハエの光遺伝学によって引き出され、アクソン死が減衰した動物は手入れを続けた。ここでは、機能変異の喪失または遺伝子の発現を利用して、軸索形態またはシナプス機能の保存を観察します。RNA干渉や組織特異的なCRISPR-Cas9媒介ノックアウトなどの他の修飾方法を適用することができます。
このメソッドは、傷害に依存しないコンテキストで使用できます。それらは、老化、軸索輸送、および無傷の軸索中の軸索小器官の間の神経維持因子の観察および特徴付けることを可能にする。
