The authors thank Mike Crickmore, Dragana Rogulja, and Michelle Frank for comments on the manuscript. Pavel Gorelik provided technical support for manufacturing the behavioral arenas. This work was conducted in Mike Crickmore's lab and is also supported by the Whitehall Foundation (Principal Investigator: Dragana Rogulja). S.X.Z. is a Stuart H.Q. and Victoria Quan Fellow at Harvard Medical School.

注：このプロトコルは、準備（セクション1から3）について説明し、2-Dの満腹アッセイの実行（第4節）、および分析（第4節）。次に、例として、ドーパミン作動性刺激を使用して、第5節では異常性欲を誘導するために2次元満腹アッセイと熱発生を起こす刺激を結合する方法を示しています。第6節では、2-Dの満腹アッセイの結果を検証する3つの方法について説明します。最後に、7節は、男性のハエで交配ドライブの回復を測定する方法を示しています。 1. 8ビットおよび32室行動アレナスを製作注：各行動アリーナは、四隅（ 図1A）のそれぞれで六角ネジと親指ナットによって一緒に保持されたレーザーカットプラスチックシートのいくつかの層で構成されています。 <ol><li>アリーナの層を作ります。適切な形状のアクリルプラスチックのシートを切断するためにレーザーカッターを使用して、各層を作製（ 図1B、製品の1Cを参照）。 注：多くの研究institutionsのは、自分のマシンショップ、メーカーのスペースでレーザーカッターを持っています。機関はレーザーカッターへのアクセス権を持っている場合は、次の手順に進みます。そうでない場合には、代わりにステップ1.2の指示に従ってください。 <ol><li>各層について、レーザーカッターのソフトウェアのデザインパターンを開きます。 注：デザインは適切な名前のPDFファイルで見つけることができる（ 例えば 、8-商工会議所アリーナ-レイヤ2 - Doors.pdf）補足資料1.このファイルにも使用されるプラスチックの種類のための注釈が含まれている（ 例えば 、1 / 8インチ（ すなわち 3.175ミリメートル）透明アクリル）。それぞれの層の正確な厚さは重要ではありません。主な要件は、0.12インチ（3ミリメートル）又はチャンバ内の空き垂直方向のスペースの多くを可能にすることです。 </li><li>型とプラスチックの厚さのためにレーザーの設定（パワー、焦点、 等）を調整することに使用されます。レーザーカッターのベッドにプラスチックを配置し、レーザーカッターを実行します。 注：これらの設定は、レーザーcutteに基づいて広く異なりますRモデルとそのレーザーの強さ。過去の経験やスクラッププラスチックのテストカットを行うことで、ベースの適切な設定を見つけます。深い六角形の彫刻は、六角ネジ頭を凹まするために、設計に含まれています。この機能は、親指ナットの片手締め付けを可能にし、アリーナは（ネジ頭を突出せず）ベンチの上に平らに休ませることができます。それにもかかわらず、深い彫刻を行うことは、しばしば達成するのが困難、かつ時間のかかる、レーザーカッターを使用しています。このステップはオプションであり、行動の結果に影響を与えずにスキップすることができます。 </li><li>ドアフレーム（レイヤ2、 図1A）を切断する際、また、チャンバ番号を彫刻するための適切なレーザー設定を使用した（ 図1B、1Cのように）設計に含まれます。 </li></ol></li><li>オンラインレーザー切断加工業者との順序を置きます。 8ビットおよび/または32室の舞台のためにすべてのPDFデザインファイルをアップロードし、材料の種類（ 例えば 、1/8インチ（ すなわち 3.175ミリメートル）CLEAを指定しますファイル内の注釈に基づいて、Rアクリル）。結果を図1B（8室アリーナ）及び1C（32室アリーナ）のように表示されます。 </li><li>プラスチック層（ 図1A）を合わせ、一緒に保持するために4本の六角ネジと4親指ナットを使用してアリーナを組み立てます。アリーナは、 図1D、1E（8室）及び図1F、1G（32室）のように表示されます。 注：（ 図1（a）のレイヤ4）食品の壁は、2-Dの満腹アッセイに使用され、求愛アッセイにおいて使用されている32室アリーナ、省略しています。 </li></ol> 2-D満腹アッセイ2.食品の準備注：2-Dの満腹アッセイは4.5時間に及ぶので、食品は栄養及び水を提供する分野で使用されて飛びます。このプロトコルは使用していますが、従来のコーンミール寒天フライ食品に限定されるものではありません。 <ol><li> 6 - 部分的にレイヤ3と2次元満腹アリーナ（8室）を構築（層の割り当てについては、 図1A参照）と親指ナットと六角ネジで締めます。 </li><li>クリーン、電子レンジでボトルに新鮮なフライ食品を置きます。ボトル（ 図2A）の底面をカバーするだけの十分な水を追加します。 </li><li> 45秒 - 30のための高い上の電子レンジフード。進捗状況を確認し、（ 図2B）溶融するまで15秒毎にかき混ぜます。 注意！フライ食品は簡単にオーバー沸騰します。 </li><li>ゆっくり〜1 mLを転送するために鈍化1,000μLピペットチップ（ 図2C）を使用し 、各チャンバー（ 図2D）に食べ物を溶融しました。 </li><li>食べ物は完全にアリーナ（ 図2F）を組み立てる前に10分（ 図2E）〜4℃で再凝固することを可能にします。 </li><li> 4℃で完了した実験の場（セクション4を参照）またはストアを使用してください。 </li><li> 4°Cおよび再利用で残飯を保管してください。 </li></ol> 3.行動アッセイのための処女雌の準備注： - 標準的な方法を用いて収集することは困難である（完全な行動アリーナのために160〜120）2-D満腹アッセイは処女雌ハエを大量に使用しています。このセクションでは、求愛のアッセイ25、29で正常に使用されているY染色体28、上のHS-HID導入遺伝子を用いて、別のアプローチを説明しています。 + / +; + / +（ブルーミントンストック番号24638）白い目処女雌を生成するために使用される株式は、遺伝子型w1118（X）/ HS-HID（Y）を有しています。 <ol><li>新しいボトルにハエをフリップ回20 -蛹の50％がeclosedている（例えば図3A参照）、十分な男性がある-株式を伝播する（5 10）。 </li><li> 1時間十分に男性（ 図3B）を殺すために、HS-HIDを活性化するために37℃の温水浴中で熱ショックオリジナルボトルを。ヒートショックの後、唯一の女性がこれらのボトルから孵化するだろうし、そうするまで処女のままになりますアッセイ。 注：（水ライン用の図3Aを参照）ボトルのすべての側面を均等に加熱されていることを確認します。 1時間は、すべての男性を安楽死させるのに十分でない場合は最大2時間、この時間を延長します。 </li><li>彼らは、29 25性的に受容するのに十分に古いであることを確認するための実験前に少なくとも3日間収集した雌を分離します。 注：Y染色体レス男性は時折、この在庫から生じます。これらの男性は白い目をしていると、彼らはHS-HID導入遺伝子が含まれていないため、熱ショックの影響を受けません。彼らは精子を生成することはできませんので、メス30、31に受容性を低下させることはできません。 </li></ol> 4. 2-D満腹アッセイを実施し、採点注：それは年齢とともに交配ドライブの変更として男性のハエの年齢を制御することが重要です。 4日齢25 -このプロトコルは、3ある男性を使用しています</suP&gt;。 <ol><li>湿度（&gt; 30％）（標準、RT実験のために、例えば 、23°C）所望の温度にインキュベーターを設定します。インキュベーターで一杯の水を残して湿度制御なしインキュベーター、で十分です。 </li><li>温度を平衡化するために、実験の過程で室内の結露を防止するために〜30分間インキュベーターで2-D満腹アッセイアリーナを置きます。回転ドアが開いた位置にあるべきです。 </li><li>アリーナ（ 図4）の各チャンバーに20処女雌- 15を吸引するためにフライアスピレーター32を使用してください。 注：これは、女性と男性が検定と同じ日に麻酔されていないことが重要です。我々の経験では、そうすることは女性の受容性と男性の交尾行動に影響を与える可能性があります。 </li><li>各チャンバ内に吸引し1男性。 </li><li> 4.5時間のための標準的な消費者のビデオカメラ（ 図5）と、膜の下インキュベーターでロードされた舞台を置きます。 </li><li>各男性が開始さを飛ぶし、各交配（ すなわち交尾）を終了したときに注目することにより、ビデオをスコア。この工程は、第1の時間がかかるかもしれません。練習で、1は、5倍以上の速度で動画を得点することができます。 注：ハエは〜23℃（高温で短い期間）29時〜20分間交尾ので、1は各交配の最初の15分で流し読みすることができます。 </li><li>すべての交配回ログインした後、各ハエのための交配の数を合計（代表結果を参照してください）。 </li><li>エソグラムを生成するために提供されたコードを使用してください。コード、命令、およびサンプルデータのための補足資料2を参照してください。 </li><li>それらを削除する前に、ハエを麻酔するためにCO 2や低温を使用してください。 </li></ol> 5. 2-D満腹アッセイで満腹感を逆に熱を生じる操作を使用しました注：定義されたニューロン集団の熱発生を起こす刺激が満腹感を克服することができるかどうかをこのプロトコルをテストします。実験FLIエスニューロン（UAS-TRPA1）の定義された集団における感熱性陽イオンチャネルTRPA1を発現します。以下の手順は、交配ドライブ25を促進することが示されているドーパミン作動性ニューロン（TH-GAL4）、の刺激に適用されます。これらのステップは、相手ドライブを促進する他の集団を検出する他の神経ドライバーと共に使用することができます。 <ol><li> thermogeneticallyインキュベーターで温度を上げる、飽き飽きしハエに交配行動を誘導するために（ 例えば 、23℃から28.5℃）、フル4.5時間2次元満腹実験を完了した後。 </li><li>インキュベーターが所望の温度に達した後、熱刺激を継続し、1時間（代表的な結果を参照）交配（ すなわち 。copulations）は、男性のスコア。 注：まだrobuを生産しながら、ニューロンの過剰刺激を防ぐ最適な条件をトラブルシューティングする必要があるので、刺激の温度と長さは、遺伝子型によって異なる場合があります目の表現型。 </li></ol> 6.満腹感を確認するために求愛し、歩行を使用しました注：このセクションでは、2-Dの満腹アッセイの結果を検証するために使用することができる3任意の方法を記載します。これらは、すべてのアッセイに必要とされません。 <ol><li>満腹感を確認するために、求愛のアッセイを使用してください。 <ol><li>吸引し求愛の分野で32室のそれぞれに1人の男性と1処女雌。 </li><li>標準的な消費者のビデオカメラを使用して、20分〜のためにハエを撮影。 </li><li>求愛25を定量化するために求愛指数（CI）をスコア。これは求愛行動を行う過ごした（ など 、以下、歌う。）時間と5分ウィンドウにわたって（ すなわち交尾）を交配の割合です。このウィンドウには求愛行動の最初のインスタンスから始まります。男性のハエは、最初の15分で求愛を開始しない場合は、そのCIが完全に飽き飽きしフライはCI bを持つべきであるのに対し、0ナイーブWTのハエは、0.9より大きいCIを示すべきです0.2をELOW。他の求愛措置も33、23と考えることができます。 </li></ol></li><li> 2次元満腹アッセイで採点求愛<ol><li>雄ハエは、2-Dの満腹アッセイ（ 例えば 、第1 の時間）の期間にわたって、求愛費やす時間の量をスコア。求愛は（ など 、以下、歌う）儀式のいずれかの手順を実行し、男性として定義されています。 6.1.3項とは異なり、このステップは、男性が交尾を費やしている時間は含まれません。 </li><li>男性は、同じ期間に（ すなわち交尾ない）交配されなかった合計時間によって上記の求愛時間を分割します。 （ - 20分60分）= 0.375、男性は最初時間かけて20分間、15分間、裁判所や仲間を飛ぶ場合たとえば、比率は15分/です。比率は、代表的な結果に「求愛の時間をnonmatingのフラクション」として示されています。 </li></ol></li><li>疲労を評価するための移動アッセイを使用して<ol><li>部分的に組み立て32すべての部品が、コントラストシートと室内アリーナ。 </li><li>求愛の分野で32室のそれぞれに吸引し男性1フライ（なし女性ハエ）。 </li><li>標準的な消費者のビデオカメラを使用して、〜10分間のハエを撮影。 </li><li> ImageJの中MTrack2プラグイン（http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html）でハエを追跡。 </li></ol></li></ol> 2-D満腹アッセイ後に交尾ドライブの回復7. <ol><li>第4章で説明したように2次元満腹アッセイを実行したが、男性は、アッセイの終了時に飛び出す吸引除去します。 </li><li>日の所望の数のために23℃で男性のハエを分離します。 </li><li>回収された雄と2次元満腹アッセイを行い、わずか1時間（代表的な結果を参照のこと）のために彼らの交配（ すなわち copulations）をスコア。 </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Motivational Systems (Problems in the Behavioural Sciences). , (1986).</li><li>Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mating+of+a+fly.">The mating of a fly.</a> Science. 264 (5166), 1702-1714 (1994).</li><li>Simpson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+manipulating+neural+circuits+in+the+fly+brain.">Mapping and manipulating neural circuits in the fly brain.</a> Advances in genetics. 65 (9), 79-143 (2009).</li><li>Venken, K. J. T., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Manipulation+of+Genes+and+Cells+in+the+Nervous+System+of+the+Fruit.">Genetic Manipulation of Genes and Cells in the Nervous System of the Fruit.</a> Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).</li><li>Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Bellen, H. J., Levis, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BDGP+gene+disruption+project:+single+transposon+insertions+associated+with+40%+of+Drosophila+genes.">The BDGP gene disruption project: single transposon insertions associated with 40% of Drosophila genes.</a> Genetics. 167 (2), 761-781 (2004).</li><li>Spradling, A. C., Stern, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Berkeley+Drosophila+Genome+Project+gene+disruption+project:+Single+P-element+insertions+mutating+25%+of+vital+Drosophila+genes.">The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes.</a> Genetics. 153 (1), 135-177 (1999).</li><li>Parks, A. L., Cook, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+generation+of+high-resolution+deletion+coverage+of+the+Drosophila+melanogaster+genome.">Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome.</a> Nature genetics. 36 (3), 288-292 (2004).</li><li>Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+resources+for+Drosophila:+the+expanding+universe.">Research resources for Drosophila: the expanding universe.</a> Nature reviews. Genetics. 6 (3), 179-193 (2005).</li><li>Ni, J. Q., Liu, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+resource+of+transgenic+RNAi+lines+for+neurogenetics.">A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics.</a> Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).</li><li>Ni, J. Q., Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+shRNA+resource+for+transgenic+RNAi+in+Drosophila.">A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila.</a> Nature. 8 (5), 405-407 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

動機づけ状態は、飽き飽きし維持、及び34を回収することができます。我々は、迅速かつ堅牢フライに交配ドライブのこれらの側面のすべてを測定する2次元満腹アッセイを提示します。このアッセイは、動機付け行動の分子や回路部品を研究するために、高度なハエの遺伝子操作を使用しての可能性を開きます。 満腹アッセイが正常に裁判所や交尾す?...

ショウジョウバエでの作業は、遺伝子1の性質を含め、多くの生物学的現象に深く、先駆的な洞察を提供している、胚発生2、概日リズム3、および神経系4、5、6の開発や配線の原則。動機は、おそらくため、これまで検討されているシステム上の制限により、これまであまりよく理解これらの現象よりも残っています。ハエにおける動機は主に脂肪沈着の明白な徴候を排除送り試合と外骨格あたりの無視できるほど小さい食物摂取に起因する多くの課題を提示し、飢餓、との関連で検討されています。したがって、ハエにモチベーションを研究するために使用されるシステムを拡張する必要があります。 我々は内交配ドライブの研究のための行動の枠組みを説明しますショウジョウバエ 。このシステムは、フライに神経遺伝ツールを利用するだけでなく、アクセシビリティ7、8、9、10、11、12、その性的二形回路8,13の推定コネクトーム。また、生来の14、15、16、17、18、19、20、21の多く及び22を学習し、23において、24感覚運動回路制御求愛は、貴重な機会を提供し、具体的に働いています動機が衝突する時に正確な回路ノードを検索します。我々は最近、フライに、人間のように、ドーパミンレベルが交配ドライブ25、26、27の中心である、と報告しました。私たちはここに25を説明するアッセイを使用して、この保存された現象の解析関連ドーパミン産生やフライにニューロンを受け、容易に詳細なmolecular-と回路レベルへの遺伝的アクセスを得ています。 私たちは、Zhang らで行動アッセイに追加します。 25我々は2次元（2-D）満腹アッセイを呼び出すビデオ得点、以前の方法に比べて重要な改善を可能にする新しいフラット行動アリーナ。その結果、新しいアッセイは、よりスケーラブルかつ定量化できる、とモチベーションに関与する遺伝子と神経細胞の遺伝子スクリーニングのために、したがって、より適しています。私たちは求愛のアッセイおよびneurogeと一緒に、この新しいアッセイを使用します磁操作は、測定し、ハエにおける交配ドライブを変更する方法を実証します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1195">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1/16 inch clear acrylic</td>
			<td style="width:119px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">8589K12</td>
			<td style="width:743px;">Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/8 inch clear acrylic</td>
			<td style="width:119px;">McMaster-Carr</td>
			<td>8589K42</td>
			<td>Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3/16 inch clear acrylic</td>
			<td style="width:119px;">McMaster-Carr</td>
			<td>8560K219</td>
			<td>Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/32 inch black delrin</td>
			<td style="width:119px;">McMaster-Carr</td>
			<td>8575K132</td>
			<td>Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hex screws, 1 inch long (50x)</td>
			<td style="width:119px;">McMaster-Carr</td>
			<td>92314A115&#160;</td>
			<td>Used to make arenas. Can be replaced by 3/4 inch screws (92314A113, McMaster-Carr) for 32-chamber arenas.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thumb nuts (25x)</td>
			<td style="width:119px;">McMaster-Carr</td>
			<td>92741A100</td>
			<td>Used to make arenas. Can be replaced by regular hex nuts (90480A005, McMaster-Carr).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Camcorder</td>
			<td style="width:119px;">Canon</td>
			<td>Vixia HF R700</td>
			<td>Can be replaced by any consumer comcorder.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring and altering mating drive in male drosophila melanogaster

調査の何十年にもかかわらず、動機づけの状態の神経細胞および分子の塩基は、神秘的なままです。我々は最近、小説、還元主義、および男性キイロショウジョウバエ （ショウジョウバエ）、ここでは詳細をWEするための方法の交配ドライブを使用して動機の徹底的な調査のためのスケーラブルなシステムを開発しました。男性の交尾ドライブが繰り返さcopulationsの過程で生殖能力と一緒に減少し、〜3日間にわたって回復所見上の行動パラダイムセンター。このシステムでは、ハエで利用可能な強力な神経遺伝ツールは、遺伝的アクセシビリティと性的行動のために利用可能な推定上の配線図で収束します。この収束は、特定の動機づけの機能を持つ小型のニューロン集団の迅速な単離および尋問を可能にします。ここでは詳細男性のハエで求愛のモチベーションを測定し、変更するために使用される満腹アッセイの設計と実行を。これを使用して、アッセイは、我々は、低雄嵌合ドライブがドーパミン作動性ニューロンを刺激することによって克服することができることを示しています。満腹アッセイは、単純な手頃な価格、および遺伝的背景の影響に対してロバストです。私たちは、満腹アッセイは動機づけの状態の神経生物学に多くの新たな洞察を生成するために期待しています。

ショウジョウバエ嵌合ドライブを特徴づけるために、3日齢、WTカントン-S男性は、2-Dの満腹アッセイで試験しました。アッセイ（4.5時間）の間に、男性が4.8±0.3の平均を交尾回数（平均値、SEMの±標準誤差を意味します）。交配は、最初の2時間（78％）（ 図6A、6B）で、主に開始し、アッセイは（ 図6A、6B）を進むにつれて少なく頻繁に?...

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Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

この記事では、モチベーションを研究するために、ショウジョウバエの melanogaste rの雄交尾ドライブを使用する行動アッセイを記載します。この方法を使用して、研究者は、この動機の根底にある、分子遺伝学、および細胞メカニズムを解明するために、高度なフライ神経遺伝技術を利用することができます。

測定とマレの変更交尾ドライブ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, ...

measuring-and-altering-mating-drive-in-male-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

11.0K ビュー.  Boston Children’s Hospital. この記事では、モチベーションを研究するために、ショウジョウバエの melanogaste rの雄交尾ドライブを使用する行動アッセイを記載します。この方法を使用して、研究者は、この動機の根底にある、分子遺伝学、および細胞メカニズムを解明するために、高度なフライ神経遺伝技術を利用することができます。 

ビデオ: Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

昆虫における単一感覚子録音キイロショウジョウバエとハマダラカ</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

神経科学

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

で逃避行動のOptogenetic刺激<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

における自発運動量の測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

社会回避での定量化のための簡単​​なアッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy and cheap methods to distinguish between individuals in a trial. A standard technique for this is CO2 anaesthesia and then labelling or wing clipping each fly. However, this is invasive and has been shown to affect behavior. Other techniques have used coloration to identify flies. This article presents a simple and non-invasive method for labelling Drosophila that allows them to be individually identified within experiments, using food coloring. This method is used in trials where two males compete to mate with a female. Dyeing allowed quick and easy identification. There was, however, some difference in the strength of the coloration across the three species tested. Data is presented showing the dye has a lower impact on mating behavior than CO2 in Drosophila melanogaster. The impact of CO2 anaesthesia is shown to depend on the species of Drosophila, with D. pseudoobscura and D. subobscura showing no impact, whereas D. melanogaster males had reduced mating success. The dye method presented is applicable to a wide range of experimental designs.

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

行動アッセイの染色昆虫：麻酔の配偶行動<em&gt;ショウジョウバエ</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a straightforward manner. As we previously demonstrated 1, in a two-dimensional chamber, we first force the flies to form a tight group, subsequently allowing them to take their preferred distance from each other. After the flies have settled, we measure the distance to the closest neighbor (or social space), processing a static picture with free online software (ImageJ). The analysis of the distance to the closest neighbor allows researchers to determine the effects of genetic and environmental factors on social interaction, while controlling for potential confounding factors. Diverse factors such as climbing ability, time of day, sex, and number of flies, can modify social spacing of flies. We thus propose a series of experimental controls to mitigate these confounding effects. This assay can be used for at least two purposes. First, researchers can determine how their favorite environmental shift (such as isolation, temperature, stress or toxins) will impact social spacing 1,2. Second, researchers can dissect the genetic and neural underpinnings of this basic form of social behavior 1,3. Specifically, we used it as a diagnostic tool to study the role of orthologous genes thought to be involved in social behavior in other organisms, such as candidate genes for autism in humans 4.

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

で社会空間に影響を与える条件<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

でMARCMベースのクローンのMechanosensationための行動アッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

パスの長さのプロトコルを採餌<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;幼虫

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

キャピラリーフィーダーアッセイにおいて食物摂取を測定します<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...