このプロトコルは、非侵襲的で高解像度の表現と成体ゼブラフィッシュ心臓機能の分析を可能にする。この方法は、成人の心臓病モデルおよび潜在的な薬物スクリーンの検証に使用することができる。この技術は正確で、再生可能な結果を提供する正しいイメージ投射のための魚の急速な位置を可能にする。
それは非侵襲的であり、魚の急速な回復を可能にする水中で行われる。画像取得用のプラットフォームを設定するには、小さいはさみやメスを使用して、12時位置のスポンジを切開します。スポンジをガラス容器に入れます。
両面テープを使用して、超音波プラットフォーム上にスポンジを含むガラス容器を貼付します。ガラス容器がプラットフォームの中央にあり、しっかりと取り付けられていることを確認します。プラットフォームホルダーの左側にあるノブを使用して、プラットフォームを約30度前方に傾けます。
ガラス容器に約200ミリリットルの魚系水を充填し、1ミリリットルトリカインメタンスルホン酸塩あたり0.2ミリグラムを含みます。オペレータに向かってトランスデューサのノッチを回す作業レールのマイクロマニピュレータホルダー内にトランスデューサを挿入します。ステージに対して作業側の縦方向で、アレイを地面に平行に保ちます。
X軸とy軸に沿って移動するために、現在接続されているトランスデューサレールシステムのために両側に約10センチメートルの十分なスペースを残します。コントロールソフトウェアにログインし、マウスの小さな血管を選択します。新しい研究だけでなく、研究で誘発された各動物のための新しいシリーズを作成します。
ブラウザページの画面左下にある新しいスタディボタンを押します。ビューは B モードで開始されます。魚網を使用して,トリケーヌのミリリットル当たり0.2ミリグラムのシステム水を含む小さなタンクに魚を移す。
魚が完全に麻酔されるまで待ちますが、動きもタッチに対する反応もありません。スポンジで魚をガラス容器に素早く移し、魚の腹側を上に向けて以前に作られた切開に移します。レールシステムのハンドルを使用してトランスデューサを縦方向に静かに下げ、オペレータに面したトランスデューサのノッチで魚の腹側を閉じます。
魚から2〜3ミリメートルのクリアランスを残します。魚の心臓が視覚化されるまで、3つの軸すべてでマイクロマニピュレータを使用してトランスデューサに対してプラットフォームを調整します。心臓を局所化した直後に、Bモードで選択または滞在し、ズームインして心臓を詳しく見てフィールドを減らします。
必要に応じて、ダイナミックレンジを45~50デシベルに設定して、画像の品質またはコントラストを高めます。[詳細] コントロール オプションの B モード コントロールに移動し、その後、モードプリセットに変更を保存します。タップモードプリセットを使用して、新しいシリーズのイメージを開始する前に毎回最適化された画像取得設定を選択します。
長軸平面で必要な数の画像を撮影します。次に、血流検出と取得用のカラードップラーに切り替えます。タッチスクリーンを使用して、房口を房室弁の上に置き、赤色信号で区別される流入を局地化します。
フレームレートを上げるには、可能な限り四分の一領域を小さくします。パルス波ドップラーを活性化して、サンプル心室血流速度に移動します。サンプルの容積ゲートを房室弁の中心に置き、最大流速を検出します。
赤い色の信号はより黄色がかった。指を使って画面上の脈波の角度を調整し、血流の方向に合わせます。開始または更新を押して、心室に流れ込む血液の速度のサンプリングを開始します。
心室と球根の間の接合部に色ドップラー象限を配置して流出速度を決定し、流れを局所化します。これは青い色の信号によって区別されます。サンプルの体積ゲートを心室球根接合の直前に配置し、血流の方向に合わせて角度補正線を調整します。
信号のピークを完全に検出してトレースするために、フロー速度パネルでベースラインを上げるのを調整します。画像の取得が完了するとすぐに, ティースプーンを使用し、トリケーヌの自由な通常のシステム気泡水に魚を転送し、魚を回復させます.回復を助けるために、水と酸素移動の通過を促進するために移管ピペットを使用してエラの上に繰り返し水を噴出。
通常、ギルの動きと水泳を再開するのに30秒から2分かかります。画像解析ソフトウェアを開きます。画像を選択し、画像処理アイコンをクリックします。
画像の明るさとコントラストを調整して、心室壁や血流パターンを明確に視覚化できるようにします。Bモード画像を使用して、心臓パッケージ測定のパラスターン長軸オプションからドロップダウンリストを開きます。LVトレースを選択し、収縮期および拡張期の心室内壁を追跡して、収縮期および拡張期および拡張期容積および終部収縮期容積の心室領域を得る。
本研究では、Bモード画像は、収縮期および拡張期における心室内壁の追跡およびチャンバーおよび壁寸法などの次元データの取得を可能にした。また、心拍数、脳卒中量、心拍出量、ならびに分面積変化および駆出率を含む心室収縮期機能のパラメータなどの機能データも得られた。色ドップラーモード画像を用いた房室弁のレベルでの測定はまた、心室の流入および流出の血流速度を提供した。
パルス波ドップラー画像に基づいて、3つの連続した大動脈流れピークをトレースすることによって心拍数値を生成した。最も重要なことは、正確なイメージングのために超音波プラットフォームと魚を正しく配置し、トリカインへの魚の暴露を最小限に抑えることです。この手順をサポートする追加の方法には、不整脈のような心臓機能不全の迅速な検出のための魚心電図または心臓組織構造または細胞死を評価する組織学的方法が含まれる。
これらの技術は、ゼブラフィッシュの心臓機能の評価を可能にし、ゼブラフィッシュ心臓病モデルにおける心臓表現型を確立する。また、新薬をテストすることができます, 心臓の損傷と再生能力を研究.トリケーヌMS-222は、皮膚、眼、および呼吸刺激性である。
トリケーヌ溶液を調製する際には、防護具には、ダストマスク、アイシールド、手袋を含める必要があります。
