たった1つの実験からの情報量は膨大です。これらの細胞壁ポリマーの存在を検出し、それらが細胞や組織にどのように分布しているかを正確に知ることができ、その存在量を決定することさえできます。この方法は、分析したい種の植物組織のほとんどすべての種類に適用することができるように設計されています。
植物組織における免疫局在化には多くの細心の注意を払った作業が必要であり、実際に何が起こるかを見ずに説明することは困難です。植物組織サンプルを採取する前に、ガラスバイアルに十分な冷たい固定液を充填して、すべてのサンプルを完全に水没させます。次に、分析する植物組織を選択し、サンプルを16平方ミリメートル以下のサイズにトリミングします。
直ちにサンプルを固定液に浸します。グルタルアルデヒドとホルムアルデヒドはどちらも優れた固定剤ですが、どちらも危険であり、フローフードで取り扱う必要があります。バイアルを真空チャンバーに移し、ゆっくりと真空を適用します。
圧力が負の60キロパスカルに達すると、バイアルの浮遊材料は底に沈み始めます。部屋の圧力は、負の80キロパスカル以下で維持します。沈むプロセスには最大 2 時間かかる場合があります。
サンプルが真空チャンバーに2時間入った後、真空をゆっくりと放出する。ガラスバイアルを密封し、摂氏4度で一晩冷蔵します。一晩固定した後、バイアルの底に沈んでいないサンプルを捨てます。
残りのサンプルを25ミリモルPBSで10分間洗浄し、25ミリモルパイプバッファーで20分間洗浄します。固定性がサンプルに浸透していない可能性が非常に高いため、すべてのフローティングサンプルを削除することは非常に重要です。エタノール系列でサンプルを脱水し、各エタノール濃度で20分間サンプルを浸漬する。
サンプルを透過するには、エタノールにLR-白色樹脂の濃度を加え、1部の樹脂からエタノールの3部に添加します。各濃度で、摂氏4度で24時間インキュベートする。LR-白樹脂をフレッシュ樹脂に交換し、さらに12時間摂氏4度でインキュベートします。
埋め込みゼラチンカプセルを用意し、サンプルを樹脂に完全に封入できるようにサンプルよりわずかに大きいカプセルを選択します。インクは樹脂を汚染するので、紙のタグに鉛筆のラベルを付けます。各カプセルの底に新鮮なLR-白樹脂を1滴塗布します。
各カプセルにサンプルを入れ、カプセルを新鮮な樹脂で最大容量に充填します。カプセルにキャップを置き、軽く押して密封します。樹脂を重合するには、24~48時間程度硬化するまで58°Cでカプセルを硬化させます。
LR-白樹脂からゼラチンカプセルを剥離した後、樹脂ブロックをステレオ顕微鏡の下に置きます。鋭利なカミソリの刃を使用して、LR-白いブロックをサンプルに対して45度の角度でトリミングします。サンプルを回転させ、90度の角度で2回目のカットを1回目にします。
同じパターンで切断を続けて、ピラミッドの頂点を持つピラミッドをサンプルの対象領域の真上に形成し、切断面がサンプルに到達するまで長軸に垂直な細かいスライスを削除します。ターゲットサンプルは、理想的には台形で囲む必要があります。トリムされた樹脂ブロックを超ミクロトームに入れる。
ナイフの端と樹脂ブロックの間の角度を調整します。200~700ナノメートルの厚さのブロックから切り取ります。ワイヤーループを使用して、サンプルされたセクションを慎重にマイクロトームから持ち上げます。
ガラスのスライドの上に蒸留脱イオン水の滴にそれらを置きます。50°Cのホットプレートにスライドを置くことによって水を蒸発させ、その後、セクションに汚れの滴を追加します。30秒後、汚れをすすいで顕微鏡下でスライドを観察し、断面の一般的な状態を確認し、所望の植物構造が見えることを確認します。
スライドの各ウェルに蒸留脱イオン水を一滴入れることで、きれいな反応スライドを準備します。1つまたは2つのサンプルセクションを水滴に移します。スライドを10センチメートルの正方形のペトリ皿に入れ、それを覆い、摂氏50度で乾燥させます。
反応スライド用のインキュベーションチャンバーを準備するには、湿らせたペーパータオルをピペットチップボックスの下部に置き、箱をアルミホイルで包みます。箱からインキュベーションチャンバーにスライドを移します。各ウェルにブロッキング溶液のピペット50マイクロリットル。
スライドを10分間インキュベートした後、ブロッキング溶液を取り出し、その後、すべてのウェルをPBSで2回、毎回10分間洗浄します。原稿に記載されている一次抗体溶液を調製した後、蒸留脱イオン水で井戸の最終洗浄を5分間行う。一次抗体溶液を反応ウェルにピペットし、次いでブロッキング溶液をコントロールウェルにピペットします。
インキュベーションチャンバーを閉じます。室温で2時間放置し、摂氏4度で一晩冷蔵します。ブロッキング溶液中に2次抗体の1%溶液を調製する。
井戸あたり約40マイクロリットルが必要になります。溶液をアルミホイルで覆います。反応スライドのウェルをPBSで2回、蒸留脱イオン水で1回洗浄し、毎回10分間洗浄します。
ブロッキングソリューションやデポジットが井戸に残らないようにしてください。二次抗体溶液を全てのウェルにピペットします。室温で3〜4時間暗い場所でスライドをインキュベートします。
繰り返しますが、反応スライドのウェルをPBSで2回、蒸留脱イオン水で1回洗浄し、各ウェルにカルコフルオールホワイトを1滴加えます。洗浄せずに、各ウェルに取り付け媒体の滴を追加し、カバースリップで各井戸をカバーします。蛍光顕微鏡を用いて反応スライドのサンプル切片を観察します。
観察ごとに、UVフィルタを使用してカルコフルオールで染色された細胞壁とFITCフィルタを使用して免疫局在を検出します。結果をより見やすくするために、ImageJ または類似の画像解析プログラムを使用して、各 UV フィルタ イメージを対応する FITC フィルタ イメージとマージします。特定のエピトープの局在を特定することにより、このプロトコルは細胞壁組成の特性評価を可能にする。
例えば、1、5-アラビナンは、現像したケルカスの細胞壁に豊富に存在する。ほとんどエステル化されたホモガラクチロンは、典型的には、器官の機械的特性を指定するケルカスベル胚の根先に見られる。キシログラクトルナンは、ケルカス・サウバー・ドングリ成熟の最終段階で、胚乳細胞などの変性細胞に見られる。
JIM13またはJIM8によって認識されるAGPのエピトープは、シロイヌズナの微小生殖に関連する細胞株や、基底性の血管精子トリトーリア水没者の汚名状乳頭および微生物など、生殖に関連する構造に見られる。このプロトコルを実装する際のよくある誤りは、通常、検出して識別するのが簡単です。この場合、開く場合、または反応ウェルを乾燥させると、通常、二次抗体がスミアとして現れます。
緑色のフルオロクロムの凝集体は、非結合一次抗体が適切に洗浄されない場合に形成されます。セクションの折り畳みまたは剥離は、通常、汚れたスライドまたは積極的な洗浄の使用による接着不良に関連しています。サンプルの準備も重要です。
樹脂ブロックは、明らかに見える淡い黄色から明るい茶色のサンプルと亀裂のないはずです。非効率的に埋め込まれたサンプルは、粉末状の白い斑点または領域を示す。サンプルサイズを8ミリメートル以下に保つことは、固定溶液の浸透に不可欠です。
不十分な固定サンプルは、濃い茶色またはほとんど黒で表示されます。温度が過大な場合、樹脂がサンプルの切り離しを行う原因となります。免疫局在化技術の使用は、いくつかの研究の方向性を開きます。
細胞壁の生化学的分析などのより具体的な技術を続けたり、分子的アプローチに進むことさえできます。この技術によって得られる結果は、細胞壁の組成を理解するのに役立つ、単純な化学分析によって分析することは非常に困難な非常に複雑な構造である。
