A quantidade de informação de apenas um experimento é enorme. Podemos detectar a presença desses polímeros de parede celular e saber exatamente como eles são distribuídos em células e tecidos, e até determinar sua abundância. Este método é projetado de tal forma que pode ser aplicado a quase qualquer tipo de tecido vegetal de qualquer espécie que alguém queira analisar.
A imunolocalização nos tecidos vegetais envolve muito trabalho meticuloso, difícil de explicar sem realmente ver o que acontece. Antes de coletar a amostra de tecido vegetal, encha um frasco de vidro com solução fixação fria suficiente para submergir completamente todas as amostras. Em seguida, selecione os tecidos vegetais a serem analisados e corte as amostras em um tamanho de no máximo 16 milímetros quadrados.
Imerque imediatamente as amostras na solução fixativa. Glutaraldeído e formaldeído são ambos excelentes fixativos, mas ambos são perigosos e devem ser manuseados na coifa de fluxo. Transfira o frasco para uma câmara de vácuo e aplique lentamente o vácuo.
Quando a pressão atingir 60 quilos negativos, o material flutuante no frasco começará a afundar até o fundo. Mantenha a pressão na câmara em não mais do que 80 quilos negativos. O processo de afundamento pode levar até duas horas.
Depois que as amostras estiverem na câmara de vácuo por duas horas, solte lentamente o vácuo. Sele o frasco de vidro e leve à geladeira durante a noite a quatro graus Celsius. Após a fixação durante a noite, descarte todas as amostras que não afundaram no fundo do frasco.
Lave as amostras restantes com PBS de 25 mililitros por 10 minutos e depois lave-as em 25 mililitros de pipes por 20 minutos. É extremamente importante remover todas as amostras flutuantes porque é altamente provável que o fixador não tenha penetrado na amostra. Desidratar as amostras em uma série de etanol, imergindo as amostras por 20 minutos em cada concentração de etanol.
Para perfundir as amostras, adicione concentrações crescentes de resina LR-branca no etanol, começando com uma parte resina para três partes de etanol. Em cada concentração, incubar por 24 horas a quatro graus Celsius. Substitua a resina LR-branca por resina fresca e incuba as amostras por mais 12 horas a quatro graus Celsius.
Prepare as cápsulas de gelatina de incorporação, selecionando cápsulas ligeiramente maiores que as amostras para que as amostras possam ser completamente incluídas na resina. Etiquetas de papel com lápis porque a tinta vai contaminar a resina. Aplique uma gota de resina LR-branca fresca no fundo de cada cápsula.
Coloque uma amostra em cada cápsula e encha as cápsulas com capacidade máxima com resina fresca. Coloque a tampa na cápsula e pressione delicadamente para selá-la. Para polimerizar a resina, cure as cápsulas a 58 graus Celsius até endurecer completamente em torno de 24 a 48 horas.
Depois de descascar a cápsula de gelatina da resina LR-branca, coloque o bloco de resina sob o microscópio estéreo. Usando uma lâmina afiada, corte o bloco LR-branco em um ângulo de 45 graus para a amostra. Gire a amostra e faça um segundo corte em um ângulo de 90 graus até o primeiro.
Continue cortando no mesmo padrão para formar uma pirâmide com o ápice da pirâmide diretamente acima da área de interesse da amostra, em seguida, comece a remover fatias finas perpendiculares para o eixo principal até que a superfície de corte chegue à amostra. A amostra alvo deve ser idealmente incluída em uma forma trapezoide. Coloque o bloco de resina aparada no ultra microtoma.
Ajuste o ângulo entre a borda da faca e o bloco de resina. Corte seções do bloco com uma espessura entre 200 e 700 nanômetros. Use um laço de fio para levantar cuidadosamente algumas seções amostradas do microtome.
Coloque-os em uma gota de água destilada desionizada em um escorregador de vidro. Evaporar a água colocando o escorregador em uma placa quente a 50 graus Celsius e, em seguida, adicione uma gota de mancha às seções. Após 30 segundos, enxágue a mancha e observe o slide sob o microscópio para verificar o estado geral da seção e que a estrutura da planta desejada é visível.
Prepare um slide de reação limpa colocando uma gota de água destilada desionizada em cada poço do escorregador. Transfira uma ou duas seções de amostra para cada gota de água. Coloque o slide em uma placa de Petri de 10 centímetros quadrados, cubra-o e deixe secar a 50 graus Celsius.
Para preparar uma câmara de incubação para os slides de reação, coloque algumas toalhas de papel umedecidas na parte inferior de uma caixa de pontas de pipeta e enrole a caixa com papel alumínio. Transfira os slides da caixa para a câmara de incubação. Pipette 50 microliters de solução de bloqueio em cada poço.
Depois de incubar o slide por 10 minutos, remova a solução de bloqueio e, em seguida, lave todos os poços duas vezes com PBS por 10 minutos cada vez. Depois de preparar as soluções primárias de anticorpos como descrito no manuscrito, realize uma lavagem final dos poços com água desomuada por cinco minutos. Pipeta a solução de anticorpos primária nos poços de reação, em seguida, pipeta a solução de bloqueio nos poços de controle.
Feche a câmara de incubação. Deixe-o ficar por duas horas em temperatura ambiente e depois leve à geladeira durante a noite a quatro graus Celsius. Prepare uma solução de 1% do anticorpo secundário na solução de bloqueio.
Aproximadamente 40 microliters por poço serão necessários. Cubra a solução com papel alumínio. Lave os poços do slide de reação duas vezes com PBS e uma vez com água desomada desomada por 10 minutos cada vez.
Certifique-se de que nenhuma solução de bloqueio ou depósitos permaneçam nos poços. Pipeta a solução de anticorpos secundários em todos os poços. Incubar os slides no escuro à temperatura ambiente por três a quatro horas.
Novamente, lave os poços do slide de reação duas vezes com PBS e uma vez com água desordenada desordenada, em seguida, adicione uma gota de Calcofluor Branco a cada poço. Sem lavar, adicione uma gota de meio de montagem para cada poço e cubra cada poço com uma mancha de cobertura. Observe as seções amostrais no slide de reação usando um microscópio de fluorescência.
Para cada observação, use um filtro UV para detectar paredes celulares manchadas pelo Calcofluor e um filtro FITC para detectar a imunolocalização. Para uma melhor visualização dos resultados, use ImageJ ou um programa de análise de imagem semelhante para mesclar cada imagem do filtro UV com a imagem correspondente do filtro FITC. Ao identificar a localização de epítopos específicos, o protocolo permite a caracterização da composição da parede celular.
Por exemplo, 1, 5-arabinan é abundante na parede celular do suber anther quercus em desenvolvimento. Mal esterified homogalacturonans são tipicamente encontrados na ponta raiz do embrião suber Quercus especificando propriedades mecânicas do órgão. Xylogalacturonans são encontrados em células degeneradas, como a célula endosperma durante os estágios finais da maturação da semente de sementes do subser Quercus.
Os epítopos da AGP reconhecidos por JIM13 ou JIM8 são encontrados em estruturas relacionadas à reprodução, como linhas celulares relacionadas à microgametogênese em Arabidopsis thaliana e as papilas estigmatéticas e microbianas da submersa de trithuria basal angiosperm. Erros comuns na implementação deste protocolo geralmente são fáceis de detectar e identificar. Quando as lavagens são ignoradas ou os poços de reação são permitidos para secar, o anticorpo secundário geralmente aparecerá como uma mancha.
Agregados de fluorocromo verde se formarão se o anticorpo primário não for lavado adequadamente. Dobrar ou desprender as seções geralmente está relacionado à má adesão devido ao uso de lâminas impuras ou lavagem agressiva. A preparação da amostra também é crítica.
Os blocos de resina devem estar livres de rachaduras com uma amostra claramente visível de amarelo pálido para marrom claro. Amostras ineficientemente incorporadas mostrarão manchas brancas em pó ou áreas. Manter o tamanho da amostra abaixo de oito milímetros é essencial para a penetração da solução fixativa.
Amostras mal fixas aparecerão marrom escuro ou quase pretas. A temperatura excessiva pode fazer com que a resina quebre, impossibilitando a secção da amostra. O uso de técnicas de imunolocalização abre várias direções de pesquisa.
Pode-se seguir com técnicas mais específicas, como a análise bioquímica da parede celular ou até mesmo proceder a uma abordagem molecular. Os resultados fornecidos por essa técnica podem ajudar a entender a composição da parede celular, uma estrutura extremamente complexa de difícil análise por análise química simples.
