Объем информации только от одного эксперимента огромен. Мы можем обнаружить наличие этих полимеров клеточной стенки и точно знать, как они распространяются в клетках и тканях, и даже определить их изобилие. Этот метод разработан таким образом, что он может быть применен практически к любому виду растительной ткани от любого вида можно проанализировать.
Иммунолокализация тканей растений включает в себя много тщательной работы, трудно объяснить, фактически не видя, что происходит. Перед сбором образца растительной ткани заполните стеклянный флакон достаточным холодным фиксаторным раствором, чтобы полностью погрузить все образцы. Затем выберите ткани растений для анализа и обрезки образцов размером не более 16 квадратных миллиметров.
Немедленно погрузите образцы в фиксаторный раствор. Glutaraldehyde и формальдегид оба отличные фиксаторы, но оба являются опасными и должны быть обработаны в потоке капот. Перенесите флакон в вакуумную камеру и медленно нанесите вакуум.
Когда давление достигнет отрицательных 60 кг паскаль, плавающий материал во флаконе начнет опускаться на дно. Поддерживайте давление в камере не более чем на отрицательные 80 кг паскаль. Процесс погружения может занять до двух часов.
После того, как образцы были в вакуумной камере в течение двух часов, медленно отпустите вакуум. Печать стеклянный флакон и хранить в холодильнике его на ночь при четырех градусах по Цельсию. После ночной фиксации отбросьте все образцы, которые не опустились на дно флакона.
Вымойте оставшиеся образцы с 25 миллимолярд pbs в течение 10 минут, а затем мыть их в 25 миллимолярд PIPES буфер в течение 20 минут. Чрезвычайно важно удалить все плавающие образцы, потому что весьма вероятно, что фиксатор не проник в образец. Обезвоживать образцы в серии этанола, погружая образцы в течение 20 минут при каждой концентрации этанола.
Чтобы пронизать образцы, добавьте увеличение концентрации LR-белой смолы в этаноле, начиная с одной части смолы до трех частей этанола. При каждой концентрации инкубировать в течение 24 часов при четырех градусах по Цельсию. Замените LR-белую смолу свежей смолой и инкубировать образцы еще на 12 часов при четырех градусах Цельсия.
Подготовьте встраиваемые желатиновые капсулы, выбрав капсулы, которые немного больше образцов, чтобы образцы могли быть полностью заключены в смолу. Этикетка бумаги теги с карандашом, потому что чернила будут загрязнять смолы. Нанесите одну каплю свежей LR-белой смолы на дно каждой капсулы.
Поместите образец в каждую капсулу, а затем заполнить капсулы до максимальной мощности со свежей смолой. Положите крышку на капсулу и нажмите осторожно, чтобы запечатать его. Для полимеризации смолы, вылечить капсулы при 58 градусов по Цельсию до полного затвердевшего около 24 до 48 часов.
После пилинга желатиновой капсулы из LR-белой смолы поместите блок смолы под стерео микроскопом. Используя острое лезвие бритвы, обрезать LR-белый блок под углом 45 градусов к образцу. Поверните образец и сделайте второй разрез под углом 90 градусов к первому.
Продолжить резки в том же шаблоне, чтобы сформировать пирамиду с вершиной пирамиды непосредственно над областью образца интерес, а затем начать удаление мелких ломтиков перпендикулярно основной оси, пока режущей поверхности достигает образца. Целевой образец в идеале должен быть заключен в трапециевидную форму. Поместите обрезанный блок смолы в ультра микротом.
Отрегулируйте угол между краем ножа и блоком смолы. Вырезать разделы из блока с толщиной от 200 до 700 нанометров. Используйте проволочную петлю, чтобы тщательно поднять некоторые отобранные секции из микротомы.
Поместите их в каплю дистиллированной деионизированной воды на стеклянную горку. Испарите воду, поместив горку на горячую тарелку при 50 градусах по Цельсию, затем добавьте каплю пятна в секции. Через 30 секунд смойте пятно и наблюдайте за слайдом под микроскопом, чтобы проверить общее состояние секции и то, что желаемая структура растения видна.
Подготовьте чистый слайд реакции, поместив каплю дистиллированной деионизированной воды в каждом колодец слайда. Перенесите одну или две секции образца на каждую каплю воды. Поместите горку в 10-сантиметровую квадратную чашку Петри, накройте ее и дайте ей высохнуть при 50 градусах цельсия.
Чтобы подготовить инкубационной камеры для реакции слайды, поместите некоторые смоченной бумажные полотенца в нижней части коробки пипетки советы и оберните коробку с алюминиевой фольгой. Перенесите слайды из коробки в инкубационный зал. Pipette 50 микролитров блокирующего раствора в каждую колодец.
После инкубации слайда в течение 10 минут, удалить блокирующий раствор, а затем мыть все скважины дважды с PBS в течение 10 минут каждый раз. После подготовки первичных антител решений, описанных в рукописи, выполнить окончательный мыть скважин с дистилляции деионизированной воды в течение пяти минут. Pipette основной раствор антитела в реакционной скважины, а затем пипетки блокирующий раствор в контрольных скважин.
Закройте инкубационую камеру. Пусть он стоит в течение двух часов при комнатной температуре, а затем охладить его на ночь при четырех градусах по Цельсию. Подготовь 1%-ный раствор вторичного антитела в блокирующий раствор.
Потребуется около 40 микролитров на колодец. Накройте раствор алюминиевой фольгой. Вымойте колодцы реакции слайд дважды с PBS и один раз с дистиллированной деионизированной водой в течение 10 минут каждый раз.
Убедитесь, что в скважинах не останется блокирующего раствора или отложений. Пипетт вторичный раствор антитела во все скважины. Инкубировать горки в темноте при комнатной температуре в течение трех-четырех часов.
Опять же, мыть колодцы реакции слайд дважды с PBS и один раз с дистиллированной деионизированной воды, а затем добавить каплю Calcofluor Белый к каждому колодец. Без мытья, добавить каплю монтажа среды для каждого хорошо и покрыть каждый хорошо с coverslip. Наблюдайте за секциями образца в реакционной слайде с помощью флуоресцентной микроскопа.
Для каждого наблюдения используйте УФ-фильтр для обнаружения клеточных стенок, окрашенных Calcofluor, и фильтр FITC для обнаружения иммунолокализации. Для лучшей визуализации результатов используйте ImageJ или аналогичную программу анализа изображений, чтобы объединить каждое изображение УФ-фильтра с соответствующим изображением фильтра FITC. При выявлении локализации конкретных эпитопов протокол позволяет характеристика состава клеточной стенки.
Например, 1, 5-арабинан в изобилии в клеточной стенке развивающегося подпотера Кверкуса. Едва эстерифицированные гомогалактуроны обычно находятся на кончике корневого эмбриона субэра Кверка с указанием механических свойств органа. Xylogalacturonans находятся в вырождающихся клетках, таких как эндосперм клетки на заключительных стадиях созревания желудя кверкуса.
Эпитопы AGP, признанные JIM13 или JIM8, находятся на структурах, связанных с размножением, таких как клеточные линии, связанные с микрогетогенезом в арабидопсис талиане, а также стигматические сосородии и микробы базальной ангиосперм тритурии субмерсы. Распространенные ошибки в реализации этого протокола, как правило, легко обнаружить и идентифицировать. Когда моет пропущены или колодцы реакции позволены высушить, вторичные антитела обычно появляются как мазок.
Агрегаты зеленого фторхрома образуются, если несырьемые первичные антитела не смываются должным образом. Складывание или отслоение секций, как правило, связано с плохой адгезией из-за использования нечистых горок или агрессивной стирки. Подготовка образцов также имеет решающее значение.
Блоки смолы должны быть свободны от трещин с хорошо видимым бледно-желтым и светло-коричневым образцом. Неэффективно встроенные образцы покажут порошкообразные белые пятна или области. Сохранение размера образца под восемь миллиметров имеет важное значение для проникновения фиксаторного раствора.
Плохо зафиксированные образцы будут выглядеть темно-коричневыми или почти черными. Чрезмерная температура может привести к смоле трещины решений секции образца невозможно. Использование методов иммунолокализации открывает несколько направлений исследований.
Можно продолжить с более конкретными методами, такими как биохимический анализ клеточной стенки или даже перейти к молекулярному подходу. Результаты, представленные этой техникой, могут помочь понять состав клеточной стенки, чрезвычайно сложной структуры, которую очень трудно анализировать с помощью простого химического анализа.
