하나의 실험에서 정보의 양은 엄청납니다. 우리는 이 세포벽 폴리머의 존재를 검출하고 세포와 조직에 어떻게 분포되는지 정확하게 알고, 심지어 그들의 풍요로움을 결정할 수 있습니다. 이 방법은 분석할 수 있는 모든 종으로부터 거의 모든 종류의 식물 조직에 적용될 수 있는 방식으로 설계되었습니다.
식물 조직에 면역 지역화는 실제로 무슨 일이 일어나는지 보고 서 설명하기 어려운, 세심한 작업을 많이 포함한다. 식물 조직 샘플을 수집하기 전에 모든 샘플을 완전히 침수하기에 충분한 차가운 고정 용액으로 유리 유리 유리병을 채웁니다. 그런 다음 분석할 식물 조직을 선택하고 샘플을 16 평방 밀리미터 이하로 다듬습니다.
수정 솔루션에 샘플을 즉시 침수합니다. 글루타랄데히드와 포름알데히드는 모두 우수한 고정제이지만 모두 위험하며 흐름 후드에서 처리해야합니다. 유리병을 진공 챔버로 옮기고 천천히 진공을 적용합니다.
압력이 음수 60킬로 파스칼에 도달하면 바이알의 부동 재료가 바닥으로 가라앉기 시작합니다. 음수 80킬로 파스칼이하로 챔버의 압력을 유지한다. 침몰 과정은 최대 2시간이 걸릴 수 있습니다.
샘플이 진공 챔버에 2 시간 동안 들어온 후 진공을 천천히 방출하십시오. 유리 유리병을 밀봉하고 섭씨 4도에서 밤새 냉장 보관하십시오. 하룻밤 고정 후 유리병 의 바닥에 가라 앉지 않은 샘플을 폐기하십시오.
나머지 샘플을 25 밀리몰러 PBS로 10분 간 세척한 다음 25밀리머 PIPES 버퍼로 20분간 세척합니다. 고정이 시료에 침투하지 않았을 가능성이 높기 때문에 모든 부동 샘플을 제거하는 것이 매우 중요합니다. 에탄올 계열에서 샘플을 탈수하여 각 에탄올 농도에서 20분 동안 샘플을 침수합니다.
시료를 견딜 수 있도록 에탄올에 LR-화이트 수지의 농도가 증가하고, 에탄올의 1부 수지부터 3부로 시작한다. 각 농도에서 섭씨 4도에서 24시간 동안 배양하십시오. LR-화이트 수지를 신선한 수지로 교체하고 샘플을 섭씨 4도에서 12시간 동안 추가로 배양합니다.
포함 젤라틴 캡슐을 준비, 샘플보다 약간 큰 캡슐을 선택하여 샘플이 수지에 완전히 동봉 될 수 있도록. 잉크가 수지를 오염시키기 때문에 연필로 종이 태그를 레이블을 지정합니다. 각 캡슐의 바닥에 신선한 LR-화이트 수지 1방울을 바치면 됩니다.
각 캡슐에 샘플을 넣고 캡슐을 신선한 수지로 최대 용량으로 채웁니다. 캡슐에 캡을 놓고 부드럽게 눌러 밀봉합니다. 수지 중합하려면 24~48시간 경화될 때까지 58°C에서 캡슐을 치료한다.
LR-화이트 수지에서 젤라틴 캡슐을 벗긴 후 스테레오 현미경 아래에 수지 블록을 놓습니다. 날카로운 면도날을 사용하여 LR-화이트 블록을 45도 각도로 트리밍하여 시료에 들어보도록 합니다. 샘플을 회전시키고 첫 번째 각도로 90도 각도로 두 번째 절단을 합니다.
같은 패턴으로 절단을 계속하여 시료의 관심 영역 바로 위에 피라미드의 정점을 가진 피라미드를 형성한 다음 절단 표면이 샘플에 도달할 때까지 주요 축에 수직으로 미세한 조각을 제거하기 시작합니다. 대상 샘플은 이상적으로 사다리꼴 모양으로 동봉되어야 합니다. 트림된 수지 블록을 울트라 마이크로토메에 놓습니다.
칼 날과 수지 블록 사이의 각도를 조정합니다. 200~700나노미터 사이의 두께로 블록의 단면을 잘라냅니다. 와이어 루프를 사용하여 마이크로토메에서 샘플링된 일부 섹션을 조심스럽게 들어올립니다.
유리 슬라이드에 증류된 탈이온 된 물 한 방울에 넣습니다. 온수 판에 50°C의 슬라이드를 배치하여 물을 증발한 다음 단면에 얼룩을 추가합니다. 30초 후, 얼룩을 헹구고 현미경 의 밑에 슬라이드를 관찰하여 단면의 일반적인 상태를 확인하고 원하는 식물 구조가 보이는지 확인한다.
슬라이드의 각 우물에 증류된 탈온된 물 한 방울을 배치하여 깨끗한 반응 슬라이드를 준비합니다. 하나 또는 두 개의 샘플 섹션을 각 물 방울로 옮습니다. 10센티미터 평방 페트리 접시에 슬라이드를 놓고 덮고 섭씨 50도에서 건조시다.
반응 슬라이드에 대한 인큐베이션 챔버를 준비하려면 파이펫 팁 박스 바닥에 약해진 종이 타월을 놓고 상자를 알루미늄 호일로 포장합니다. 상자에서 인큐베이션 챔버로 슬라이드를 전송합니다. 파이펫 50 마이크로리터의 블로킹 용액을 각 우물에 넣습니다.
슬라이드를 10분 동안 배양한 후 차단 용액을 제거한 다음 매번 PBS로 모든 우물을 두 번 씻습니다. 원고에 설명된 바와 같이 1차 항체 용액을 준비한 후, 5분 동안 증류수로 우물의 최종 세척을 수행한다. 파이펫은 1차 항체 용액을 반응 우물로 들어간 다음 차단 용액을 제어 우물로 피펫합니다.
인큐베이션 챔버를 닫습니다. 실온에서 2시간 동안 방치한 다음 섭씨 4도에서 밤새 냉장 보관하십시오. 차단 용액에서 이차 항체의 1%용액을 준비한다.
우물 당 약 40 마이크로 리터가 필요합니다. 알루미늄 호일로 용액을 덮습니다. PBS로 반응 슬라이드의 우물을 두 번 씻고 매번 증류 된 탈온 화 된 물로 한 번 씻으십시오.
차단 솔루션이나 예금이 우물에 남아 있지 않도록 하십시오. 이차 항체 용액을 모든 우물에 파이펫합니다. 실온에서 어둠 속에서 슬라이드를 3~4시간 동안 배양합니다.
다시 말하지만, PBS로 반응 슬라이드의 우물을 두 번 씻고 증류 된 탈온 화 된 물로 한 번 씻은 다음 각 우물에 Calcofluor White 한 방울을 추가하십시오. 세탁하지 않고, 각 웰에 장착 매체의 한 방울을 추가하고 커버 슬립으로 각각 을 잘 커버. 형광 현미경을 사용하여 반응 슬라이드의 샘플 섹션을 관찰한다.
각 관찰에 대해 UV 필터를 사용하여 칼코플루어와 FITC 필터에 의해 염색된 세포벽을 감지하여 면역지역화를 감지합니다. 결과를 더 잘 시각화하려면 ImageJ 또는 유사한 이미지 분석 프로그램을 사용하여 각 UV 필터 이미지를 해당 FITC 필터 이미지와 병합합니다. 특정 에피토프의 국소화를 정확히 찾아서, 프로토콜은 세포벽 조성물의 특성화를 가능하게 한다.
예를 들어, 1, 5-아라비난은 개발 중인 퀘르쿠스 스터버 개미의 세포벽에 풍부하다. 드물게 에스테르화된 균갈락투로난은 일반적으로 장기의 기계적 특성을 지정하는 퀘르쿠스 스터버 배아의 근끝에서 발견된다. Xylogalacturonans는 Quercus suber 도토리 성숙의 마지막 단계 도중 내정자 세포와 같은 퇴행성 세포에서 발견됩니다.
JIM13 또는 JIM8에 의해 인식된 AGP의 전형은 아라비도시스 타리아나에서 의외의 유두및 미생물과 관련된 세포주와 같은 생식과 관련된 구조에서 발견된다. 이 프로토콜을 구현하는 일반적인 실수는 일반적으로 쉽게 감지하고 식별할 수 있습니다. 세차를 건너뛰거나 반응 우물이 건조될 경우, 이차 항체는 일반적으로 얼룩으로 나타납니다.
녹색 불소 크롬의 응집체는 결합되지 않은 1 차 항체가 제대로 씻겨 있지 않으면 형성됩니다. 섹션의 접이식 또는 분리는 일반적으로 부정한 슬라이드 또는 공격적인 세척의 사용으로 인한 불량 한 접착과 관련이 있습니다. 샘플 준비도 중요합니다.
수지 블록은 밝은 갈색 샘플에 명확하게 보이는 옅은 노란색균열이 없어야합니다. 비효율적으로 내장된 시료는 분말백색 반점 또는 영역을 표시합니다. 샘플 크기를 8밀리미터 미만으로 유지하는 것은 고정 솔루션의 침투에 필수적입니다.
잘못 고정된 샘플은 짙은 갈색 또는 거의 검은색으로 나타납니다. 과도한 온도로 인해 수지가 균열되어 시료의 단면이 불가능해질 수 있습니다. 면역 지역화 기술의 사용은 여러 연구 방향을 엽니 다.
하나는 세포벽의 생화확적인 분석과 같은 보다 구체적인 기술로 따라가거나 분자 접근법을 진행할 수도 있다. 이 기술에 의해 제공된 결과는 간단한 화학 분석에 의해 분석하기가 매우 어려운 세포벽의 조성을 이해하는 데 도움이 될 수 있다.
