このプロトコルは、発達中の魚の遺伝子のノックダウンと過剰発現、および血液細胞に対するそれらの下流の影響の定量を可能にするので重要である。このプロトコルは、迅速で、実行が容易で、経済的で、適切な計測器へのアクセスで自動化が容易です。この手順を実証することは、クリステン・ルーブです, 研究室の学部研究者.
受精後5~200時間、48時間の間でプラスチック10センチメートルのペトリ皿に移すことから始めます。胚が下端に沈むように皿を傾け、できるだけ多くのE3媒体を皿から取り除きます。次に、500マイクロリットルのデコールリオネーションプロテアーゼを胚に加える。
室温で5分後、すべての胚をプレートの下端にもう一度チップし、皿の側面を静かにタップし、胚がプレートの底に軽くこすって帯状子を完全に取り除きます。スクイーズボトルを使用すると、プロテアーゼを希釈するために約20ミリリットルのE3培地を加え、胚が沈着します。次に、培地をデカントし、プロテアーゼのすべての痕跡を除去することを実証したように、新鮮な培地でさらに3回胚をリンスする。
解離のために胚を準備するには、P1000ピペットを使用して5〜10個の胚を1個に、1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、移されたE3培地を吸引する。次いで、胚性ゼブラフィッシュにE3培地に10ミリモルDTTの1ミリリットルを加え、マイクロ遠心チューブを室温で30分間水平位置に置き、粘液コーティングを除去します。胚解離の場合、DTT処理胚を1回のDPBSで3回洗浄し、1回の洗浄でカルシウムとマグネシウムを補います。
カルシウムとマグネシウムを添加したDPBSの500マイクロリットルを加える前に、5ミリリットル/ミリリットル、解離プロテアーゼ。その後、水平軌道シェーカーで1分あたり185回転で摂氏37度でサンプルを60分間インキュベートします。胚を消化し過ぎないように、定期的に胚をチェックしてください。
固体組織が存在する完全に均質でないサンプルが観察される場合、サンプルが完全に解約されるまでP1000ピペットで胚を三分子化する。解離されたゼブラフィッシュ胚細胞をフローサイトメトリー用に調製するには、細胞サンプル全体を5ミリリットルポリスチレン丸底管の上部貯留層に移し、35マイクロメートルの細胞ストレーナーキャップを付けます。カルシウムやマグネシウムを含まない4ミリリットルのPBSでキャップをリンスし、遠心分離によって細胞をペレットにします。
その後、チューブ当たりのカルシウムとマグネシウムなしでPBSの500マイクロリットルで細胞を再懸濁します。ゼブラフィッシュ胚細胞のフローサイトメトリック解析では、各チューブに赤死細胞染色の1〜1000希釈を加える前に、細胞懸濁液を穏やかに渦液する。死細胞染色を施してから30分以内に、廃棄物タンクを空にし、シースタンクに適切な溶液を充填し、流動サイトメーターの流体システムを開始する。
解析ソフトウェアでは、5 つのプロットを描画し、前方対側散乱を測定する最初のプロットを設定します。前方散乱を線形に、側面散布を対数に設定します。2 番目のプロットは、前方散乱の高さと前方の散乱幅を測定するように設定し、3 番目のプロットは、散乱高さと側面の散乱幅を測定します。
X軸上の赤死細胞染色を測定する4番目のプロットを設定し、死んだ細胞からの生きた細胞の識別を可能にするためにy軸上の側面散乱を設定します。第5のプロットは、選択した蛍光素を測定するために設定する必要があります。すべてのプロットが設定されたら、サンプルをサイトメーターにロードし、流量を減らしてセルがすぐに不足しないようにします。
細胞集団の大部分を明確に観察できるように前方および側面の散乱設定を調整し、細胞集団の周囲にゲートを描画する。このゲートセルにラベルを付けます。2 番目のドット プロットがセルにゲート付きで、前方散乱にゲートを設定し、側面がダブレットを除外する横の散布のシングルを配置します。
4番目のプロットでは、赤死細胞染色設定を調整して、明らかに負の母集団が存在するようにします。これらのセルの周りにゲートを描画し、このゲートのライブ セルにラベルを付けます。5番目のプロットでは、生細胞にゲートを付けて正のセルの周りにゲートを描画し、各サンプルを実行して少なくとも25,000個のライブセルイベントを収集します。
すべてのサンプルを分析したら、シャットダウン手順に従って流体をオフにし、シースタンクを補充し、廃棄物タンクを空にします。各胚性ゼブラフィッシュ試料からのGFP陽性赤血球の割合を分析した後、全ての対照群の平均を算出することができる。通常、平均は 1 として設定され、すべてのパーセンテージがこの参照点から計算されます。
本代表分析では、特定のモルフォリノを用いてISM1転写産物を減少させ、受精胚の48時間以内に存在するGFP陽性赤血球の数を減少させることが決定された。外因性mRNAを有するISM1モルフォリノレベルのこの減少を救い、赤血球の数を正常に戻す。サンプルの適切な消化は重要です。
あなたが過剰に消化または過少消化した場合、あなたは正しい結果を得ることはありません。ファックス機が利用可能な場合、研究者は、インビトロ培養、RNAシーケンシング、定量RT-PCRを選別することによって血液細胞を収集することができます。
