著者らは、これらの技術の開発を支援私たちの研究室の過去と現在のメンバーに感謝。部分的な資金調達、再生医療/ CIRM（RN1-00538）のためのカリフォルニア工科大学からの助成金によって、DEに提供。

1。ゼブラフィッシュ畜産、胚発生、治療<ol><li>制度的動物管理使用委員会（IACUC）の指導の下で、NIHまたはその他の規制機関/ガイドラインの動物保護ガイドラインの範囲内で、以下のゼブラフィッシュのプロトコルを実施しています。 </li><li>特定の組織、細胞、または器官内の蛍光タンパク質を発現するゼブラフィッシュの株は、ゼブラフィッシュ国際リソースセンター（ZIRC）から入手できます。例えば、Tgは（KDR：EGPF）は、このプロトコルに示されるように完全な3D血管構造を製造するために使用することができる血管内皮細胞6にEGFPを発現するS843。トランスジェニックゼブラフィッシュの他の行はZIRCから入手できます。 </li><li> pHは、塩分濃度、温度、溶存酸素、光、および他の環境要因7を監視し、適切な養殖システムの住宅の大人のゼブラフィッシュ。ここに示したゼブラフィッシュは、14時間営業のLIGと28.5℃でAquaneering株式会社システム（カリフォルニア州サンディエゴ）で飼育したht/10時間暗のサイクル。フィード大人のゼブラフィッシュブラインシュリンプとNRD 4月6日魚食（ブラインシュリンプ直接、オグデン、ユタ州）のバランスの取れた食事。 </li><li>成人男性と繁殖可能年齢の女性のゼブラフィッシュは、交尾成功高めるために別々に収容する必要があります。 </li><li>ゼブラフィッシュ大人に合格するためには卵がフォールスルーするのは十分な大きさが、あまりにも小さな穴を持つメッシュボトムを持っている相手側の容器で一緒に（2-4）、女性を配置することにより、産卵と受精を刺激し、男性（4-6） 。前夜交配を設定;卵は昼間の光周期が徐々に強度（夜明け）に増加し、通常ながら、夜明け近くにレイアウトされている。すべての15〜30分、相手コンテナの底に卵を確認してください。 </li><li> E3バッファー（5のNaCl、0.17のKCl、0.33のCaCl 2、0.33 mMのMgSO 4）したメッシュストレーナーとクリーンを使って卵を収集します。 28℃のインキュベーター内のE3バッファとストアで満たされた100mm培養プレートに卵を移す。 </li><li> CERを変える化学物質を研究するために、所望の化学濃度を追加分岐ebrovascular。例えばneovasular分岐がγ-セクレターゼ阻害剤（GSI IX/DAPT/N- [N-（3,5 - Difluorophenacetyl-L-アラニル）]-S-phenylglycinet-ブチルエステル）で誘導することができる24を、初めにDMSO中で可溶化4時間後に受精（HPF）。その時点での胚は、絨毛膜の中に残っているし、多くの化学物質がその8を通過することができる。処理条件は、絨毛膜の自由になる胚の能力を損なうことがあり、神経や運動の効果がある場合、胚はプロナーゼ2のいずれかの鉗子を用いて行うことができる24〜48 HPF、の間で解除chorionatedする必要があります。提供された画像に示された胚を静かに2本の尖ったピンセットで絨毛をつかみ、それを開いた引き裂くことによって絨毛膜を除去した。 </li><li>所望/必要に応じて、顔料の形成は24ゼブラにおけるE3緩衝液に0.003％N-フェニルチオ尿素（PTU）を添加することによって阻害することができる。 </li></ol>脳血管構造体の2。共焦点イメージング固定ゼブラフィッシュ胚におけるURES <ol><li> 250 mg / Lのトリカインメタンで胚を犠牲にしてから、2に浸漬することにより、それらを修正 - 4℃で一晩4％パラホルムアルデヒド蛍光胚を持つコンテナは、箔に包まれなければならない。画像化されるまで一度固定、胚は、4℃でPBS中に保存されるべきである - EGFP蛍光強度は約一週間後にあまり解決になりますが、形態は（明視野で見て）はるかに長く保持されます。 </li><li>最初の尖ったタングステン針を用いて1の目を削除することによって胚をマウントするために準備します。筋肉を切断し、最終的には目を置換する視神経をカットまず目を結ぶ組織の周りにカット。 （注：両サイドを画像化することは、両眼を削除希望する場合。） </li><li>目が除去されると、3％のメチルセルロースのドロップを使ってカバーガラス上で胚をマウントします。オリエント胚削除された目のある側がカバーガラスに直面して、できるだけガラスに近くなるとなるよう。メチル全体胚をカバー撮像中に乾燥を防ぐためにlcellulose。 </li><li>画像すぐに高品質20Xプランアポ目標（開口数= 0.75以上）を備えた倒立型共焦点顕微鏡を使用してマウント胚。この構成は、二つのガラス面間の胚を挟んで、上部ガラスに対して胚を押す必要とする非倒立顕微鏡に好適である。 </li><li>中·大口径の設定を使用して1μm刻み光学スライスを収集します。 2.5μmの大きい工程を使用することもできるが、それは小さなオブジェクトの空間的順序を決定することはより困難であり得る。小さな開口部は、シャープなディテールを生産するが、必要な長いスキャンは、EGFPを漂白しても達成することができる胚にイメージングの深さを制限することがあります。共焦点顕微鏡は、胚を通じて半分程度イメージングを可能にします。 </li><li>全体魚の撮影が必要な場合は、最初に両眼を削除する（ステップ3.2に注を参照）、イマジン後の胚を回転させる反対側のための2.5 - G 1側とを繰り返して、2.3を繰り返します。 </li></ol>胚ゼブラフィッシュ脳血管系の3。3次元再構成<ol><li> 3Dレンダリング、無料で、パソコン、MacおよびLinuxコンピュータとの互換性のために最適化されたオープンソースのImageJ（http://fiji.sc）、フィジー分布3を使用してください。 </li><li>プラグイン&gt; LOCI&gt; BioFormatsインポーター9その後 、ニコンスタック（ 図2A）用など name.idsを共焦点のファイルを選択するために行くことによって、フィジーへのインポート共焦点スタック。スプリットチャンネルをチェックして、オートスケールを確認して、グレースケール：Hyperstack、カラーモードを見るこのスタックを選択します。 </li><li>これらの選択は、4つの別々のチャンネルパネルを開きます。 EGFP 1つだけが、通常、第三のいずれかの下に必要とされるであろう。 C = 1（ 図2A）に続く長い名前の16ビット画像を残して、他の3パネル（赤、青、アルファ）を閉じます。 </li><li>画像がスクロールTAを使用しますが、スキャンでスレッショルドを調整B目的の領域または構造を持つスライスを見つけるため底部に沿って、その後（ 図2C）&gt;しきい値を調整&gt;画像に移動します。 </li><li>登場パネルで、構造が背景に非常によく見ることができるように、左側にある最上部のバー（黒レベル）をスライドさせ、それが（ 図2D）である下段（白レベル）のまま。白黒を選択して、暗い背景を選択します。別の調整は各スライスのために必要とされる場合を除き、各画像についての計算しきい値を選択し、黒の背景を選択しないでください。このプロセスは、新たな8ビットの画像を作成する。 </li><li>警告：しきい値を元に戻すか、保存されたImageJの中なので、共焦点スタックは変更が必要になるたびに再読み込みする必要がありますすることができません。番号を書き留めて、望ましい結果が達成されるまで、別の設定を試してみてください。 </li><li>緑の3D出力を作るために赤と青のカラーボックスの選択を解除し、因子1（最高の）または2（良い）をリサンプリング、プラグイン&gt; 3Dビューア&gt;しきい値0に行く - それ以外の場合は、WILL白レンダリングを生成- （非オート）（ 図2E）適用]を選択します。 </li><li>回転スピンし、マウスとキーボードのコントロール（ 図2F）を使用して3D画像をズームします。 </li><li>メニューのキャプチャ]オプションを使用して、任意のポイントで、静止画を保存します。スクリーン上の画像ボックスのサイズは、高解像度の画像が右下隅をドラッグして、ボックスを大きくすることが望まれる場合のように生成される画像のピクセル寸法を決定する。 </li><li> [表示]&gt; [録音360度回転します（ 図2G）を選択することにより、スピニング3Dムービーを作成します。回転ステップごとに2度のデフォルトは、それははるかに小さいファイルサイズが作成されている、例えば5度に変更することができますが、アニメーションにぎくしゃくを追加することがあります。 </li><li>後、メディアプレーヤーを表示して、インターネットへのアップロード、またはPowerPointプレゼンテーションで使用するためのいくつかの利用可能な形式のいずれかでファイルを保存します。オープンソースのメディアプレーヤー、VLC（ <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">HT</a>TP :/ / www.videolan.org / VLC / index.htmlを）無料で、非常によく、これらのビデオを処理します。 </li></ol>

<ol>
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J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. 68, e4272 (2012).</li></ol>

開示することは何もありません。

ここに記載されている方法は、ゼブラフィッシュの開発に血管系の視覚的な研究のための基盤を提供します。固定したサンプルは、高解像度の共焦点画像化。 ショウジョウバエおよびC.のために使用することができるが、ライブの標本は、例えば、心拍数および心臓の拍出量のような生理学的パラメータを評価するために使用することができる虫は全身イメージングを可能にするが、ゼブラフィッシュは、脊椎動物であり、内皮細胞で裏打ち血管系を含む脊椎動物の組織のための有用なモデルを提供する。これらの研究は、ゼブラフィッシュの研究コミュニティからの重要なトランスジェニック系統とゲノムリソースを組み込むことができます。 3D再構成及び胚ゼブラフィッシュからの共焦点画像のレンダリング、ここで説明するように、血管の分岐や、ラットやマウスのような大きな動物モデルでは不可能な血管密度のシステム生物学的アプローチが可能になります。さらに、ゼブラフィッシュは、変更可能な環境（E3バッファ）で開発する羊膜のように、どこで人は簡単にCを追加することができます血管の発達に影響する特定の酵素または他のプロセスを阻害するhemicals。化学物質デリバリーの濃度およびタイミングは微調整処理条件に研究を可能にする、変更することができる。 1。変更およびトラブルシューティングこのシステムへの変更は10組織、臓器または地域特有の様々なパターンにEGFPまたは他の蛍光タンパク質を発現するゼブラフィッシュのトランスジェニック系統を組み込むことができます。さらに、ゼブラフィッシュ網膜における血管新生の変化の分析は、最近5を出版されました。年齢以上の胚および成体ゼブラフィッシュにおける色素沈着の問題は、スケール顔料または網膜色素を産生しないトランスジェニック系統と交配することによって補償することができる。減少した蛍光に関する問題は、一般的に不適切な固定条件から生じる。 1日のパラホルムアルデヒド（4％）が最適であるが、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウム又はアルコールなどのより強力な固定剤は、よいEGFP蛍光を破壊する。固定後、胚を4℃のPBSに保つ必要があり、常に直射日光の当たらない。 この技術の2。制限事項このプロトコルを用いて製造さ3Dレンダリングの品質と解像度は、生成された画像の品質に依存します。これらの胚を通る光の浸透は、標準の共焦点顕微鏡を用いて正中矢状平面に制限されています。イメージングのこの態様は、古い胚および成人における撮像の深さを制限するが、より高度なマルチフォトン顕微鏡検査システムは、より大きな深さでの撮像を可能にする。 既存の方法に関して3。意義このプロトコルは、動物全体を組み込むことができ、システムレベルでの血管網の分析へのアプローチを提供します。そのようなデータの以前の表現はよく一緒にレイアウトされた一連の画像に依存していましたが、3Dレンダリング、空間RELAの優れた分解能を提供します関わっtionships。 4。将来のアプリケーションイメージングおよび組織処理における新たな展開は、古い胚、大人の透明11-14行うことを含むことがあり、これらの方法には多くの新しいアプリケーションを提供します。強化された透明性を大幅に共焦点と多光子レーザーによる組織への浸透を増加します。また、カメラ、光電子増倍管のような分析速度の4 番目の次元を提供し、それはすぐにリアルタイムで魚の3Dレンダリングを生成することが可能であってもよい増やす。 5。重要なステップこのプロトコルにおける重要なステップは、適切な固定を含んイメージングのための準備である。イメージングは​​、利用可能な最良の数値開口を有し、高品質目標で固定した後、できるだけ早く行う必要があります。解像度が使用される画像化システムに依存するため、高品質なシステムは一般に良好である。 3Dレンダリングを生成することは、メモリを集中的にメモリと良好なグラフィックス·プロセッサを大量に持つので、より新しい、ハイエンドのコンピュータに推奨されています。 これらの方法は、ニューロン、筋肉、腺または任意の数の集団において、GFP、または他の蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック胚に適合させることができるが、ここで説明視覚生物系は、血管内皮細胞にEGFPを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュのために最適化された他のセル。このシステムでの作業中の主な利点は、固定および/または生きた動物では、この発達期間中の任意の時点で全体の胚で何が起こっているのか研究する能力である。

ゼブラフィッシュは、発生生物学を研究するための強力なシステムを提供し、その胚の相対的な透明度は、画像ベースの研究1の影響を受けやすい。ゼブラフィッシュは今何十年脊椎動物の発生のモデルとして使用されている。ゼブラフィッシュを含む硬骨魚は、無脊椎動物には合理的なホモログを持たない単純化された脊椎動物の血管系を持っている。血液は、それが酸素化されたえら、を介して2つのチャンバ型の心臓の前房から汲み上げられる。鰓からの血液は背側大動脈に収束し、最終的に臓器組織中の毛細血管に到達し、より小さな血管に動脈をその枝を通過する。毛細血管酸素以内に放出され、二酸化炭素が吸収される。毛細管血の静脈側にますます大きな静脈に流れ、最終的にサイクルが繰り返される心臓の房に引き込まれる。 大人のゼブラフィッシュは、一度に200個以上の卵を産み、そしてONCできeは受精し、彼らはすぐに2を開発しています。 1日以内に、体軸は、その契約と絨毛膜の内側の周りの胚を動かす筋肉を含めて、十分に開発されている。 2-7日後に受精（DPF）からほとんどのボディシステムは、目や食べ物に向かって、または離れて明るい光から泳いで調整することができ、中枢神経系を含めて、開発しています。最大7のdpf胚は、顕微鏡による可視化を可能にするのに十分に小さい。蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック系統は、共焦点又は蛍光顕微鏡で画像化することができる。共焦点イメージングは、血管発生のシステム生物学の視点を提供するゼブラフィッシュ胚における完全な血管構造の3Dレンダリングを作成するためのオープンソースソフトウェア3とペアにすることができます。それが血管網4,5のシステムレベルの分析を可能にするので、血管や脳血管の複雑さの変化に関係する研究では、このプロトコルの恩恵を受ける。メソッドやリソースのコンパイルが提供され胚ゼブラフィッシュにおける血管構造の画像化を必要とする研究のために簡単に養子にし、これらの技術のようにするD。動物モデルとしてゼブラフィッシュのコスト効率は、脊椎動物の発生や恒常性の分子経路の血管新生効果を評価するとともに、新たなプラットフォームを提供するために、新たな画像処理技術と組み合わせている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="889">
	<tbody>
		<tr>
			<td>N &#8211; Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, catalog #41972</td>
			<td></td>
			<td>0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Mat-Tek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSI IX/DAPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates&#160;</td>
			<td>Becton-Dickinson, cat# 351147</td>
			<td></td>
			<td>BD Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>VWR,&#160; cat #414004-001</td>
			<td></td>
			<td>VWR disposable transfer pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-cellulose&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, cat#43146</td>
			<td></td>
			<td>3% in E3 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRD 4/6 Fish food&#160;</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Dried</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Live</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire&#160;</td>
			<td>Small Parts # TW-016-60</td>
			<td></td>
			<td>0.016&#8221; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>VWR # 101107-950</td>
			<td></td>
			<td>Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and 3d reconstruction of cerebrovascular structures in embryonic zebrafish

ゼブラフィッシュは、 生体内で発生生物学や病理学を研究するための強力なツールです。小型でゼブラフィッシュ胚の相対的な透明度は、心臓や血管の開発などのプロセスを視覚的に検査のために特に有用なものにする。いくつかの最近の研究で、血管内皮細胞におけるEGFPを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュが画像に使用し、共焦点顕微鏡を用いて、脳および網膜において複雑な血管網を分析する。説明は、準備処置および画像増強緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現するゼブラフィッシュ胚を、次いで脳血管系の総合的な3Dレンダリングを生成するために設けられている。プロトコルは、胚の治療、共焦点イメージング、EGFP蛍光を維持する固定プロトコルを含む。さらに、近くの神経組織にダメージを与えることなく、このような除去などの脳血管構造の高品質の画像、目の取得の有用なヒントが用意されています。潜在的な落とし穴共焦点イメージングでは、自由に利用できるオープンソースソフトウェアを用いた共焦点画像スタックからの3次元再構成を生成するために必要な手順に沿って、議論されている。

血管構造の3次元再構成は、ゼブラフィッシュの開発の包括的かつ視覚的に興味深い視点を提供します。これらは一般的に行われているよう1および2の表示方法を示す 。 図3は、内皮細胞におけるEGFPを発現したゼブラフィッシュ胚DPF 6で血管構造のいくつかの角度を示している。固体緑または白の色では、信号強度を評価することが困難なことができます。擬似着色ルックアップテーブルから画像強度を提供し、構造が重なった場合より良好な奥行き知覚を可能にする。ゼブラフィッシュのdpf 6の脈管構造の疑似着色3D画像の一例を図4に提供されているライブ胚の蛍光イメージングは、目と身体の動き、および心臓活動を含む生理学的特性を研究するために使用することができる。 図3及び図4トランスジェニックゼブラフィッシュラインを使用して、これらの方法で得られた代表的な結果を示している<html>記載され。撮像分解能は、顕微鏡の特性に依存するが、EGFP信号の輝度は、ほとんどの市販のシステムとの良好な画像品質のために十分である。 3D表現の復興とレンダリングは一貫しており、このオープンソースソフトウェア内のオプションは、一貫して良好な結果を提供します。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> 図1。赤目除去。 A）タングステン必要性と、固定3 DPFの胚は、目の隣に配置。組織は、この位置から目の周りカットされます。B）目が抜けていると基本的な眼の筋肉と視神経が切断されています。空の眼窩は、点線の円で示されている。C）は 、同じ胚を裏返して上に向けインタクトな目で、メチルセルロースが搭載されている。<html> hres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 <img alt="図2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> 図2。ステップバイステップの共焦点画像スタックの3次元再構成。 A）関心領域とスライスを見つけた後。B）を選択するためにプラグイン&gt; LOCI&gt; Bioformatを使用してフィジーにロードファイルを開く（4104.1.ids）、しきい値調整を示す。C）として選択されたしきい値は、トップを使用して214に調整されているスライダー、[適用方向について、3次元再構成をそのまま目でゼブラフィッシュの図示されている）のように、D）3Dビューアが呼び出され、Eが選択されています。F）の画像をズームや回転している。G）の 360度回転の映画図示のように行われる。<html> res.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> 図3。3次元再構成からの視点。 A）10倍の目的で画像化6 DPF胚の内側の視点、口が右側にあり、口の中ではないエラ。 のB同じ胚の）横方向、ノートフィンが途中でループです。20X目的で画像化、C）と同じ胚、 20X客観的イメージングの中間視点、ノート鰓の解像度。D）横視点。フィンは、パネルの右端にある。20X客観的イメージングのE）の前-内側図、右側に20X客観的、頭、それを用いて画像化、同じ胚の口の中の音符のエラ。F）腹部。右下の卵黄嚢に血管系に注意してください。jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 <img alt="図4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> 図4。6 DPF胚における強度差。信号強度のための疑似カラールックアップテーブルを用いて、6 DPFの再構築のイメージ。口、脳、えらや卵黄嚢はオリエンテーションのためにラベルが付いています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> 図5。4 DPFのゼブラフィッシュにおける再構築された血管系の映画は。魚は2.5程度で画像化した。イメージはなかった胚の半分を撮像する。 図6に提供GSI処理ゼブラフィッシュにおける構造と血管構造を比較してください。頭の中の血管の低い密度と大きなエラに注意してください。 （ダウンロードの下の「Zfish_spin.avi「補足ファイルを参照してください） <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> 図6。4 DPFのGSI処理胚における血管系の3Dムービー。魚が正中線の側方から貫通2.5ミクロンで画像化した。 図5に示す制御4 DPFの魚と血管構造を比較してください。アーチ型のバックと小型化、この化学物質で処理された胚における典型的なものである。 （ダウンロードの下の「GSI-treated_4dpf_fish.avi「補足ファイルを参照してください）

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Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

幼虫ゼブラフィッシュにおける脳血管の開発の撮像が記載されている。 3Dイメージングを容易にし、化学的処理を用いて脳血管発達を改変するための技術も提供される。

イメージングおよび胚ゼブラフィッシュにおける脳血管構造物の3次元再構成

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.7K ビュー.  Western University of Health Sciences. 幼虫ゼブラフィッシュにおける脳血管の開発の撮像が記載されている。 3Dイメージングを容易にし、化学的処理を用いて脳血管発達を改変するための技術も提供される。 

ビデオ: Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

生物学

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

組織標的胚キメラ：ゼブラフィッシュの原腸胚細胞移植

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

ゼブラフィッシュ胚眼の組織の顕微解剖

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

ディテールに秘められたゼブラフィッシュ胚心臓の免疫染色

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

のためのシステム<em&gt; ex vivoで</em胚膵臓&gt;培養

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

ゼブラフィッシュ胚骨格筋のレーザー招いた傷害

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

解離調製物から胚および幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋線維の分析

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

蛍光タンパク質を発現する生きたマウスでのイメージング細胞内の構造物の生体顕微鏡

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.