この体外病モデルは、全血と患者由来細胞、具体的には内皮、血栓原性および抗凝固剤の有効性を評価する相互作用を研究するために使用することができる。これは、内皮細胞は、様々な状況で使用することができ、カスタムメイドのマイクロ流体を導入するか、または血流パラメータを調整することによって変更することができます。さらに、このモデルは、炎症性の状態で血栓のダイナミクスを研究したり、抗凝固剤および抗血小板療法の効果を評価するために使用することができます。
最終的には、これらのアプローチは、個別化された医療の方法で使用することができます。外科用ヒト肺動脈組織サンプルを得た後、1ミリリットルフィボロネクチン当たり5マイクログラムの2ミリリットルで高親和性細胞結合60ミリリットル細胞培養皿をコーティングし、少なくとも15分間摂氏37度で皿をインキュベートする。インキュベーションの終わりには、滅菌条件下で層流キャビネットに滅菌鉗子を使用し、組織をPBSのペトリ皿に移す。
組織がまだリングにある場合は、内皮が損傷して除去されやすいように、血管の最も内側の層に触れないように、はさみで開いた動脈を切断します。フィブロネクチンを取り除いた後、完全な内皮細胞培地の4ミリリットルを皿に加え、鉗子を使用して組織サンプルを媒体に移し、メスを使用して容器の内層を慎重に媒体に削り取り、血管壁に観察される脂質蓄積を避けるように注意する。細胞が収穫された後、プレートを細胞培養インキュベーターに入れる。
繊維芽細胞が培養を汚染する場合は、CD144に磁気親和性細胞分離を使用し、細胞を精製するメーカーの指示に従ってください。一般的に、培養は純粋なものと定義され、フローサイトメトリーが10%以下の汚染細胞を検出する場合である。実験用に十分な数の内皮細胞が得られた場合、一次内皮細胞は、内皮細胞特異的マーカーの存在および平滑筋および上皮細胞マーカーの存在を特徴とすることができる。
流れチャンバの準備のために、0.1%ゼラチンの30マイクロリットルで6つの井戸流れスライドの1チャネルをコードし、37°Cで少なくとも15分間このスライドをインキュベートする。商業流れチャンバに加えて、特定の次元のカスタムメイドの流れチャンバーは、血栓のダイナミクスに対する血管形状の影響を研究するために使用することができる。スライドがインキュベートされている間、 EDTAとトリプシンと沈血を伴うコンフルエント肺動脈内皮細胞培養から細胞を収集し、遠心分離によって細胞を600マイクロリットルの完全な内皮細胞培地に再び懸濁させ、強引に、各チャネルに100マイクロリットルの細胞を加え、完全な内皮細胞チャネルに50マイクロリットルを追加して、完全な内皮細胞チャネルに追加の50マイクロリットルを追加します。、摂氏37度および5%の二酸化炭素での一晩のインキュベーションに十分な培地を提供するために、翌日、非結合細胞を洗い流すために培地を変える。
培養で6日後、細胞は安定したコンフルエント単層を形成しているはずである。7日目の肺動脈内皮細胞培養では、抗凝固治療を受けていない被験者から109個のクエン酸抗凝固管に静脈血球サンプルを取得し、血液を50ミリリットルチューブに移す。血液にはウイルスやその他の感染因子が含まれている可能性があります。
したがって、常に手袋を着用し、人間の材料を扱うための安全指導に従うことが重要です。1~10,000マイクログラムのカルセインAMレッドと1ミリリットル当たり50マイクログラムの血液細胞を蛍光的に標識し、Alexa 488フィブリノーゲンを加え、37°Cで血液を15分間インキュベートして完全な吸収を可能にする。灌流の30分前に、肺動脈内皮細胞を、内皮細胞培地中の1マイクロモルヒスタミン100マイクロリットル、および他の添加物を含まない1%のウシ胎児血清で治療する。
そして、洗浄システムチューブをすすぐために洗浄バッファーで満たされた20ミリリットルのシリンジを使用し、洗浄バッファーの2ミリリットルで3分の1〜20ミリリットルのシリンジをロードし、シリンジをシリンジポンプにロードします。2番目の20ミリリットルシリンジを使用して、フローチューブにヒッピーと1%のウシ血清アルブミンを含むバッファを充填し、肘の形状のローラコネクタを使用してチューブを慎重にマイクロスライドに接続し、スライドのコンセントを注射器に接続し、スライドを含むセルをステージに配置して顕微鏡から修復し、実験用のセットアップを組み立てます。、顕微鏡を調整し、イメージングのパラメータを設定します。強調血液の再石灰化。
そして、これは凝固の幸せな共同スポンサーであり、さらにこれは内皮細胞層を損傷し、結果に影響を与えるので、気泡の形成を避けるようにしてください。灌流の直前に、再石灰化バッファーで血液を2回希釈し、マイクロスライドの入口チューブを血液のチューブに入れ、注射器ポンプで開始を押します。血液が内皮を流れ始めるとすぐに、顕微鏡を押して、事前に選択されたアクティブチャネルと関心のある領域の位置を使用して、5分間15秒ごとに画像を取得します。
分析の最後に、記録と注射器ポンプを停止し、適切にクリーンアップします。カルセインAMレッドとアレクサ488共役フィブリノーゲンの添加と血小板のラベリングは、血小板接着および繊維および沈着による血栓形成の調査を可能にする。非刺激条件下では、内皮に血小板またはフィブリンの結合がない。
ヒスタミンによる刺激は、2.5分後に血小板付着の即時増加をもたらし、この時点で、血小板凝集およびフィブリノーゲン切断をフィブリンに誘導するオートクリン因子を分泌し始め、3分後に繊維および沈着をもたらし、4分後に血小板と安定した凝集物を形成する。直接抗凝固剤による治療は、未処理の血液と比較して血栓形成および血小板接着の両方を阻害する。肺動脈内皮細胞血小板相互作用の免疫蛍光分析は、5分間の灌流後の肺動脈内皮細胞相互作用の維持を明らかにし、細胞接触は、血管内皮カドヘリン染色によって確認されるように、内皮間隙間の基底のマトリックス上に血栓が形成されることを示す。
ヒト臍帯静脈内皮細胞は、肺動脈内皮に比べて血小板付着およびフィブリン沈着量が少ないことを示す。特に、慢性血栓塞栓性肺高血圧患者由来の疾患原発性肺動脈内皮細胞は、健康な細胞に比べて血小板付着およびフィブリン沈着量の増加を示す。内皮の血栓形成性は、血管床の起源または生物学的背景の部分のような複数の要因に依存する。
このプロトコルを使用して、血管および血液成分における固有の機能不全、ならびに抗凝固療法の有効性は、血栓症止血症の異なる段階で試験することができる。このプロトコルは、血液およびテオ相互作用を理解するために使用することができ、抗凝固療法に対する患者固有の応答を予測する究極の可能性を有する様々な血栓塞栓性疾患において。
