脳卒中は、世界中の死亡率と障害の主な原因です。一部の患者では、血栓溶解や脳血管閉塞の外科的除去が可能であるが、脳卒中に対する効果的な治療法が依然として急務である。ここでは、脳卒中治療の潜在的なレジメンとして、虚血性半球への幹細胞のカテーテルベースの動脈内送達を実証する。
まず、注射カテーテルと手術用フックの準備方法を紹介します。動脈内注射用の2種類の注射カテーテルを設計しました。設計1は、チューブのフラッシュを必要としない溶液または懸濁液の注入に使用される。
設計2は、神経幹細胞の注入を可能にし、その後、全容を提供するために死んだボリュームのフラッシュが続きます。注射カテーテルのセットを構築するには、26ゲージと20ゲージ針、MRE 25カテーテルの10〜15センチメートルの長さ、MRE 50とMRE 10カテーテルの3センチメートルの長さが必要です。針の先端の両方を切り取り、サンドペーパーの金属端を磨いてチューブを開き直し、端を滑らかにし、蒸留水で洗い流してボアをきれいにし、破片を洗い流します。
図は、針先を切り取った後の20ゲージ針のクローズエンドを示しており、研磨後に滑らかなボアで再開されます。顕微鏡下で、MRE 50管の端に20ゲージ針を挿入します。26ゲージ針を曲げ、20ゲージ針先の先端の下にチューブを貫通します。
スーパー接着剤で26ゲージ針を固定します。次に、2つの針ハブとチューブとエポキシを埋め込み、強さを高めるために固体ブロックを構築します。また、外科部位のより良い露出のために、組織を位置に保持するために3つの外科用フックが必要になります。
27ゲージの針から長さ1.5センチから2センチメートルの長い針シャフトを切り、紙の上で両端を鈍くなるまで磨きます。小さな止血クランプを使用して、シャフトを一方の端のフックに曲げ、もう一方の端にリング状を曲げてください。長さ10~15センチのMRE 25カテーテルをリングに挿入し、透明な外科テープで固定します。
同じメソッドを使用して、さらに 2 つのフックを作成します。フックおよびカテーテルシステムは殺菌のために70パーセントエタノールに一晩浸すべきである。動物の被験者に関するすべての手順は、ケンタッキー大学の制度的動物管理および使用委員会によって承認されました。
ENT胚マウス脳を使用してGFP、陽性神経幹細胞を培養します。GFP陽性胚は、蛍光顕微鏡上のFITCチャネルで容易に可視化することができる。野生型胚は同じ暴露を使用して蛍光を示さないが。
野生型胚の自己蛍光は、暴露時間が100倍に増加した場合にのみ可視である。胚性皮質は、製造業者のプロトコルに従って神経幹細胞培養を確立するために収集され、使用される。これらの神経幹細胞は神経球を形成することができ、10世代以上の通過であり、グリアに分化することができる神経細胞である。
ナノグ、SSEA1、Oct4およびSox3などの胚性幹細胞マーカーのパネルは、神経圏にいる間に幹細胞の特性を同定するために使用することができる。神経球は、製造業者のプロトコルに従ってメディアで培養され、神経幹細胞送達のための通路3と5の間で使用した。マウスとラットの両方について左半球で虚血性脳卒中を誘導し、フィラメントベースのフィラメントを用いて、中大脳動脈閉塞、MCAOを種に応じていくつかの修飾を行った。
マウスでは、フィラメントは一般的な頸動脈、CCAを介して挿入され、ICAの内部頸動脈に進入する。ラットでは、フィラメントは、より大きな作業スペースのために、外的頸動脈を介して導入され、ECAはICAに導入される。ここでは、マウスの手術を示します。
首に沿って正中線切開を行った後、鈍い解剖を使用して下層組織を分離する。より良い視野を達成するために27ゲージ針シャフトから作られた3つの微小外科フックを使用してください。黒い四角は、次のステップの手術領域を示します。
左CCAの上の筋肉層は、左CCAと迷走神経を露出させるために慎重に開いています。CCAに従って分岐に到達し、識別します。このCCAまたは迷走神経を伸ばしたり、置き換えたり、圧迫したりしないように注意してください。
CCAと迷走神経を覆う明確な結合組織を慎重に開きます。鉗子の先端をこのCCAの下のスペースを解放し、CCAの茎をできるだけ隔離して下さい。CCAの下に二本鎖6つのO編組ナイロン外科縫合糸を通す。
中央点をカットして、CCAの根底にある縫合糸に任せます。CCAの下に別のナイロン縫合糸を置きます。上縫合糸にスリップノットを結び、緩く保ちます。
2つの下縫合糸を分離します。スリップノットを中央縫合糸で結び、今のところ緩く保ちます。外科医の結び目を下縫合糸で結び、可能な限り近位端に移動します。
縫合端の端をトリムダウンします。さらに分岐を超えてCCAを露出する。上の緩いスリップノットを分岐に押し込み、それを締めて血液の逆流を防ぎます。
CCAの隣に70ナイロンMCAO縫合をコーティングしたシリコンゴムを置きます。マイクロハサミを使用して、CCAの小さな切開を下の結び目の隣に切ります。この切開を通して、MCAO縫合の先端をCCAに挿入し、上結び目に進めます。
中央ノットの位置を調整し、MCAO縫合を保持できる位置まで締めます。結び目を過度に締めないでください。上のノットを解放しますが、同じ位置で別の緩いスリップ ノットを作成します。
MCAO 縫合を ICA に進めます。MCAO 縫合糸が二股をICAに渡すのを確認します。縫合糸の経路は比較的まっすぐで、進行するにつれて組織に深く入り込むべきである。
縫合線端のシルバーマーカーを確認します。分岐に達していることを確認します。MCAO 縫合線の方向をもう一度確認します。
上と中央の結び目を調整して、血液漏れを防ぎます。さらに MCAO 縫合糸を進め、2 つの上の結び目を締めて MCAO 縫合糸を所定の位置に固定します。虚血の1時間の記録時間を開始します。
1時間の虚血の後、動物を麻酔し、皮膚の傷を再開します。手術領域を露出する。上部と中央のスリップノットを見つけます。
上の結び目を静かに解放します。白いシリコンゴム部分が中間結び目に達するまで、MCAO縫合をそっと引き抜きます。上結び目を締めて MCAO 縫合糸を所定の位置に保持し、出血を避けます。
中のスリップノットをそっと解放します。MCAO縫合糸を引き出して、その端が上の結び目を通過します。上の結び目を締めます。
CCAの切開のすぐ上に中央のスリップノットを置きます。中央のスリップノットを締めます。上の結び目を削除します。
中央ノットの縫合端の端をトリムします。皮膚の傷を閉じ、動物が回復できるようにします。私たちの経験に基づいて、神経幹細胞は脳卒中の1〜3日後にこの動脈経路を通って安全に注入されました。
繰り返しますが、神経幹細胞注射のためのマウスとラットの手術の間にわずかなバリエーションがあります。ここでは、マウスの手術を実証します。3日目の脳卒中では、動物を麻酔し、創傷を再開し、CCAを再び露出させる。
CCAの下に二本鎖の外科縫合糸を置き、2つの縫合糸を得るために中点でそれを切る。2つの縫合線を適切に配置します。上縫合糸でスリップノットを作ります。
分岐のすぐ下に配置します。上のスリップノットを締めます。中央縫合糸で別のスリップノットを作成します。
脳卒中手術から残っているトリミングされた結び目のすぐ上に小さな切開をカットします。MRE 10カテーテルの先端を約45度の角度でトリムします。この鋭い端を使用して、CCAの切開部に入る。
入り角とカテーテルの挿入に使用する力を適切に調整するように注意してください。さもなければ、カテーテルはCCAに入らないか、または穿刺するかもしれない。カテーテルを挿入し、先端が上の結び目に達するまで前進します。
カテーテルを所定の位置に保持し、血液のリンケージがないことを確認するために、中のスリップノットを締めます。上の結び目を離します。上縫合糸でスリップノットを作ります。
血液の速い逆流が見えるまでCCA内のカテーテルの角度と両方の結び目の位置を調整し、カテーテルとCCAの流れの間の通信が成功したことを示す。シリンジポンプを開始します。カテーテルの血液はCCAに戻されます。
5分後に注射を終了します。上の結び目をリゲートします。真ん中の結び目を解放し、カテーテルを引き出します。
真ん中の結び目をリゲートします。すべてのノットをトリムします。傷口を閉じ、動物が回復することを許可します。
動脈内注射後、GFP標識神経幹細胞は、主に両側半球に見られる。ここでは、注射後1日に海馬歯状回の分布を示す。二側半球では、一部のGFP陽性神経幹細胞が皮質および線条体に局在し、未熟なニューロンのマーカーである二重皮質を発現する。
これらは、注射後7日で神経幹細胞注射の有無にかかわらず、シャムおよび脳卒中動物からの代表的な画像である。出産後30日で、車両注射を受ける動物のFITCチャネルを介してわずかな自己蛍光のみを検出することができる。幹細胞が動物を注入している間、GFP標識された神経幹細胞は、gleoマーカーGFPまたは神経マーカートゥフアンのような様々な細胞マーカーの発現を伴う負傷した脳に見つけることができます。
各画像の白い矢印は、それぞれGFPまたはトゥフアンマーカーを発現する神経幹細胞を示す。結論として、動脈内注射は脳卒中治療のための神経幹細胞の送達のための実行可能な方法である。神経幹細胞は、負傷した脳内の異なる細胞タイプに生き残り、分化することができます。
そして最後に、ここで紹介した動脈内注射法は、溶液や懸濁液の送達にも使用できる。
