Инсульт является основной причиной смертности и инвалидности во всем мире. Хотя тромболизис и хирургическое удаление Окклюзии сосудов головного мозга могут быть выполнены у отдельных пациентов, по-прежнему существует настоятельная необходимость в эффективной терапии против инсульта. Здесь мы демонстрируем катетерную внутритеррикальную доставку стволовых клеток в ишемическое полушарие в качестве потенциального режима терапии инсульта.
Во-первых, мы представляем, как подготовить инъекционный катетер и хирургические крючки. Мы разработали два типа инъекционных катетеров для внутритериальных инъекций. Дизайн один используется для инъекции раствора или подвески, которая не требует промывки трубки.
Конструкция 2 позволяет впрыскить нервные стволовые клетки, после этого флеш мертвого тома для того чтобы поставить полный том. Чтобы построить набор инъекционных катетеров, вам понадобится 26 калибровочных и 20 калибровочных игл, от 10 до 15 сантиметров длины катетера MRE 25 и трех сантиметров длины катетеров MRE 50 и MRE 10. Отрежьте обе иглы советы и полировать металлический конец на наждачной бумаге, чтобы вновь открыть трубку и сгладить края, а затем заподлицо с дистиллированной водой, чтобы очистить отверстие и смыть мусор.
На рисунке показан закрытый конец 20 калибровочных игл после отсечения кончика иглы, который вновь открывается с гладкой скважины после полировки. Под микроскопом вставьте 20 калибровочных игл в конец трубки MRE 50. Согните 26 калибровочных игл, а затем проникнуть трубки ниже конца 20 калибровочных иглы кончика.
Безопасные 26 калибровочных иглы с супер клей. Затем вставлять два игольчатых концентраторов и труб и эпоксидной смолы, чтобы построить твердый блок для повышения прочности. Вам также понадобится три хирургических крючка, чтобы держать ткань в положении для лучшего воздействия хирургических участков.
Вырезать полтора-два сантиметра длиной иглы вал от 27 калибровочных иглы и полировать оба конца на наждачной бумаге до скучно. Используйте небольшой гемостатический зажим, чтобы согнуть вал в крюк на одном конце и кольцеобразной формы на другом конце. Вставьте через кольцо катетер длиной от 10 до 15 сантиметров MRE 25 и закретуте его четкой хирургической лентой.
Сделайте еще два крючка, используя тот же метод. Крючки и катетер системы должны быть пропитаны на ночь в семьдесят процентов этанола для стерилизации. Все процедуры, связанные с предметами животных, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Университете Кентукки.
Мы используем ЛОР эмбриональный мозг мыши для культуры GFP, положительные нервные стволовые клетки. Положительные эмбрионы GFP можно легко визуализировать в канале FITC на флуоресцентном микроскопе. В то время как эмбрионы дикого типа не показывают флуоресценции, используя ту же экспозицию.
Аутофторесценция эмбрионов дикого типа видна только тогда, когда время экспозиции увеличивается в 100 раз. Эмбриональная кора собирается и используется для создания нейронных культур стволовых клеток в соответствии с протоколом производителя. Эти нервные стволовые клетки могут образовывать нейросферы и может быть проход в течение 10 поколений, и они могут дифференцироваться в глии нейронов.
Панель эмбриональных маркеров стволовых клеток, таких как наног, SSEA1, Oct4 и Sox3 могут быть использованы для определения свойств стволовых клеток в то время как в нейросферах. Нейросферы были культурны в средствах массовой информации, следуя протоколу производителя и использовать между проходами три и пять для доставки нервных стволовых клеток. Ишемический инсульт был индуцирован в левом полушарии для мышей и крыс, используя нить на основе, средней мозговой артерии окклюзии, MCAO с некоторыми изменениями в зависимости от вида.
У мышей, нить вставляется через общую сонную артерию, CCA и передовые во внутреннюю сонную артерию, ICA. В то время как у крыс, нить вводится через внешнюю сонную артерию, ЭКА в ICA из-за большего рабочего пространства. Здесь мы демонстрируем хирургию мыши.
После принятия среднего разреза вдоль шеи, отделить основные ткани с помощью тупого вскрытия. Используйте три микрохирургических крючка из 27-го калибра иглы валы для достижения лучшего поля зрения. Черный квадрат указывает хирургическую область для следующего шага.
Мышечный слой над левой CCA тщательно открыт, чтобы разоблачить левый CCA и блуждающий нерв. Следуйте CCA, пока вы не достигнете и определить бифуркации. Осторожность следует проявлять, чтобы не растянуть, вытеснить или сжать этот CCA или блуждающий нерв.
Тщательно откройте четкую соединительной ткани, покрывая CCA и блуждающий нерв. Освободите пространство под этим CCA с кончиком типсов и изолировать стебель CCA как можно больше. Нить двухместный шесть O плетеные нейлона хирургический шов под CCA.
Вырезать среднюю точку, чтобы оставить на швы, лежащие в основе CCA. Поместите еще один нейлоновый шов под CCA. Свяжите slipknot на верхнем шве, держа его свободно.
Раздели два нижних шва. Свяжите скольжение узел со средним швом, сохраняя его свободным на данный момент. Свяжите узел хирурга с более низким швом и переместите его в проксимальный конец, насколько это возможно.
Обрезать шов заканчивается. Далее разоблачить CCA за бифуркации. Нажмите верхний свободный slipknot к бифуркации и затянуть его, чтобы предотвратить обратное поток крови.
Положите кремниевую резину покрытием 70 нейлона MCAO шов рядом с CCA. Используя микро ножницы, вырезать небольшой разрез на CCA, рядом с нижним узлом. Вставьте кончик шва MCAO в CCA через этот разрез и перейти его к верхнему узлу.
Отрегулируйте положение среднего узла и затяните его до тех пор, пока он не сможет удерживать шов MCAO в положении. Не затягивайте узел чрезмерно. Отпустите верхний узел, но сделайте еще один свободный узел скольжения в том же месте.
Продвижение шва MCAO в ICA. Подтвердите, что шов MCAO передает бифуркацию в МКА. Путь шва должен быть относительно прямым, вступая глубже в ткани, как она продвигается.
Проверьте серебряный маркер на конце шва. Убедитесь, что он достигает бифуркации. Проверьте направление шва MCAO еще раз.
Отрегулируйте верхние и средние узлы, чтобы не было утечки крови. Далее заранее шов MCAO, затянуть два верхних узла, чтобы обеспечить шов MCAO на месте. Начните записывать время в течение одного часа ишемии.
После одного часа ишемии, мы анестезировать животное и вновь открыть рану кожи. Разоблачить хирургическую область. Найдите верхние и средние slipknots.
Аккуратно отпустите верхний узел. Аккуратно вытащите шов MCAO до тех пор, пока белая силиконовая резиновая часть не достигнет среднего узла. Затяните верхний узел, чтобы держать шов MCAO на месте, чтобы избежать кровотечения.
Аккуратно отпустите средний slipknot. Вытащите шов MCAO до тех пор, пока его конец не пройдет верхний узел. Затяните верхний узел.
Поместите средний slipknot прямо над разрезом на CCA. Затяните средний slipknot. Снимите верхний узел.
Обрезать шовные концы среднего узла. Закройте рану кожи и дайте животному восстановиться. Основываясь на нашем опыте, нервные стволовые клетки безопасно вводят через этот артериальный маршрут от одного до трех дней после инсульта.
Опять же, Есть незначительные различия между мышью и крысы операций для инъекций нервных стволовых клеток. И здесь мы демонстрируем операцию на мышке. На третий день после инсульта, анестезировать животное, вновь открыть рану и повторно разоблачить CCA.
Положите двойной пряди хирургического шва под CCA и сократить его в середине, чтобы получить два шва. Поместите два шва должным образом. Сделать slipknot с верхней шва.
Поместите его прямо под бифуркацией. Затяните верхний slipknot. Сделайте еще один slipknot со средним швом.
Вырежьте небольшой разрез прямо над подстриженным узлом, оставшимся после операции по удалению инсульта. Обрезать кончик катетера MRE 10 с углом около 45 градусов. Используйте этот острый конец, чтобы войти в разрез на CCA.
Будьте осторожны, чтобы правильно настроить угол входа и силу, используемую для вставки катетера. В противном случае катетер не может попасть в CCA или проколоть его. Вставьте катетер и заранее, пока кончик не достигнет верхнего узла.
Затяните средний slipknot держать катетер на месте и обеспечить отсутствие связи крови. Отпустите верхний узел. Сделать скольжения узел с верхней шва.
Отрегулируйте угол катетера внутри CCA и положения обоих узлов до тех пор, пока не будет виден быстрый задний поток крови, что указывает на успешную связь между катетером и потоком CCA. Запустите шприц-насос. Кровь в катетере будет смыта обратно в CCA.
Прекратите инъекцию через пять минут. Ligate верхний узел. Отпустите средний узел и вывямите катетер.
Лигейт средний узел. Обрезать все узлы. Закройте рану и дайте животному восстановиться.
После внутриартериальной инъекции, GFP помечены нервных стволовых клеток в основном находятся в полушарии ипсилатеральной. Здесь мы показываем распределение в гиппокампе дентат извилины на один день после инъекции. В ипсилатеральной полушарии, некоторые из GFP положительные нервные стволовые клетки локализованы в коре головного мозга и стриатума, выразить двойной корт, маркер незрелых нейронов.
Это репрезентативные изображения от фиктивных и инсульта животных с или без инъекций нервной стволовой клетки через семь дней после инъекции. Через 30 дней после родов, только незначительные авто флуоресценции могут быть обнаружены через канал FITC у животных, которые получают инъекции транспортного средства. В то время как в стволовых клетках инъекционных животных, GFP помечены нервные стволовые клетки могут быть найдены в травмированном мозге с выражением различных маркеров клеток, как глео маркер GFP или нейрональный маркер tujuan.
Белые стрелки на каждом изображении указывают на нервные стволовые клетки, выражаюющие маркеры GFP или tujuan соответственно. В заключение, внутритериальная инъекция является возможным методом доставки нервных стволовых клеток для терапии инсульта. Нейронные стволовые клетки могут выжить и дифференцироваться в различные типы клеток в травмированном мозге.
И, наконец, введенный здесь внутритериальный метод инъекций также может быть использован для доставки растворов и суспензий.
