Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie

Schlaganfall ist weltweit die Hauptursache für Sterblichkeit und Behinderung. Obwohl Thrombolyse und chirurgische Entfernung von zerebralen Gefäßverschlüssen bei ausgewählten Patienten durchgeführt werden können, besteht nach wie vor ein dringender Bedarf an wirksamen Therapien gegen Schlaganfall. Hier zeigen wir eine katheterbasierte, intraarterielle Versorgung der ischämischen Hemisphäre als potenzielles Therapieschema für die Schlaganfalltherapie.

Zuerst stellen wir vor, wie man den Injektionskatheter und chirurgische Haken vorbereitet. Wir haben zwei Arten von Injektionskathetern für die intraarterielle Injektion entwickelt. Design eins wird für die Injektion einer Lösung oder Suspension verwendet, die keine Spülung des Rohres erfordert.

Design zwei ermöglicht die Injektion von neuronalen Stammzellen, gefolgt von einer Spülung des toten Volumens, um das volle Volumen zu liefern. Um einen Satz Von Injektionskathetern zu bauen, benötigen Sie 26 Gauge- und 20-Meter-Nadeln, eine Länge von 10 bis 15 Zentimetern MRE 25 Katheter und drei Zentimeter Länge von MRE 50 und MRE 10 Katheter. Schneiden Sie beide Nadelspitzen ab und polieren Sie das Metallende auf Schleifpapier, um das Rohr wieder zu öffnen und die Kanten zu glätten und dann mit destilliertem Wasser zu spülen, um die Bohrung zu reinigen und Schmutz abzuwaschen.

Die Abbildung zeigt ein geschlossenes Ende einer 20-Meter-Nadel nach dem Abschneiden der Nadelspitze, die nach dem Polieren mit einer glatten Bohrung wieder geöffnet wird. Setzen Sie unter dem Mikroskop die 20-Spur-Nadel in das Ende der MRE 50-Schläuche ein. Biegen Sie die 26-Spur-Nadel und durchdringen Sie dann die Schläuche unter dem Ende der 20-Meter-Nadelspitze.

Sichern Sie die 26-Spur-Nadel mit Superkleber. Dann betten Sie die beiden Nadelnaben und die Schläuche und Epoxid, um einen festen Block zu bauen, um die Festigkeit zu erhöhen. Sie benötigen auch drei chirurgische Haken, um das Gewebe in Position zu halten, um die chirurgischen Stellen besser zu belichten.

Eine eineinhalb bis zwei Zentimeter lange Nadelwelle von einer 27-Spur-Nadel schneiden und beide Enden auf Schleifpapier polieren, bis sie stumpf sind. Verwenden Sie eine kleine hämostatische Klemme, um die Welle in einen Haken an einem Ende und eine ringförmige am anderen Ende zu biegen. Legen Sie einen 10 bis 15 Zentimeter langen MRE 25 Katheter durch den Ring und sichern Sie ihn mit klarem Operationsband.

Erstellen Sie zwei weitere Hooks mit der gleichen Methode. Die Haken und das Kathetersystem sollten über Nacht in 70 Prozent Ethanol zur Sterilisation eingeweicht werden. Alle Verfahren, die tiertierische Themen betreffen, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Kentucky genehmigt.

Wir verwenden HNO embryonale Maus Gehirn, um GFP zu kulturieren, positive neuronale Stammzellen. GFP-positive Embryonen können im FITC-Kanal leicht auf einem Fluoreszenzmikroskop visualisiert werden. Während Wildtyp-Embryonen zeigen keine Fluoreszenz mit der gleichen Exposition.

Die Autofluoreszenz von Wildenembryonen ist nur sichtbar, wenn die Belichtungszeit um das 100-fache erhöht wird. Embryonale Kortex wird gesammelt und verwendet, um neuronale Stammzellkulturen nach dem Herstellerprotokoll zu etablieren. Diese neuronalen Stammzellen können Neurosphären bilden und können über 10 Generationen durchgehen und sie können sich in Glia unterscheiden sind Neuronen.

Panel von embryonalen Stammzellmarkern wie Nanog, SSEA1, Oct4 und Sox3 kann verwendet werden, um die Stammzelleigenschaften in Neurosphären zu identifizieren. Neurosphären wurden in den Medien kultiviert, nach dem Herstellerprotokoll und verwendung zwischen den Passagen drei und fünf für die Neuronalstammzellabgabe. Der ischämische Schlaganfall wurde in der linken Hemisphäre sowohl für Mäuse als auch für Ratten induziert, wobei eine filamentbasierte, mittlere Zerebrale Arterienverschluss, MCAO mit einigen Modifikationen je nach Art verwendet wurde.

Bei Mäusen wird das Filament durch die gemeinsame Halsschlagader, CCA, eingeführt und in die innere Halsschlagader ICA vorgeschoben. Bei Ratten wird das Filament durch die äußere Halsschlagader ECA in die ICA eingeführt, da der größere Arbeitsbereich größer ist. Hier zeigen wir die Mauschirurgie.

Nach einem Mittellinienschnitt entlang des Halses, trennen Sie die darunter liegenden Gewebe mit stumpfer Sezierung. Verwenden Sie die drei mikrochirurgischen Haken aus 27-Spur-Nadelwellen, um ein besseres Gesichtsfeld zu erreichen. Das schwarze Quadrat zeigt den Operationsbereich für den nächsten Schritt an.

Die Muskelschicht über dem linken CCA ist sorgfältig geöffnet, um den linken CCA und vagus Nerv zu belichten. Folgen Sie dem CCA, bis Sie die Bifurkation erreichen und identifizieren. Vorsicht sollte geboten werden, um diesen CCA- oder Vagusnerv nicht zu dehnen, zu verdrängen oder zu drücken.

Öffnen Sie vorsichtig das klare Bindegewebe und decken Sie den CCA- und Vagusnerv ab. Befreien Sie den Raum unter diesem CCA mit einer Spitze der Zange und isolieren Sie den CCA-Stamm so weit wie möglich. Fädeln Sie eine doppelsträngige sechs O geflochtene Nylon chirurgische Naht unter dem CCA.

Schneiden Sie den Mittelpunkt, um die Nähte zu verlassen, die dem CCA zugrunde liegen. Legen Sie eine weitere Nylon-Nähte unter die CCA. Binden Sie einen Slipknot auf die obere Naht, halten Sie es locker.

Trennen Sie die beiden unteren Nähte. Binden Sie einen Schlupfknoten mit der mittleren Naht, halten Sie es für den Moment locker. Binden Sie den Knoten eines Chirurgen mit einer niedrigeren Naht und bewegen Sie ihn so weit wie möglich an das proximale Ende.

Trimmen Sie die Nähtenachlten nach unten. Setzen Sie die CCA über die Bifurkation hinaus weiter aus. Drücken Sie den oberen lockeren Slipknot auf die Bifurkation und ziehen Sie ihn fest, um einen Blutrückfluss zu verhindern.

Legen Sie die silikongummibeschichtete 70 Nylon MCAO Naht neben die CCA. Schneiden Sie mit einer Mikroschere einen kleinen Schnitt auf dem CCA neben dem unteren Knoten. Setzen Sie die Spitze der MCAO-Nähte durch diesen Schnitt in die CCA ein und bringen Sie sie auf den oberen Knoten vor.

Passen Sie die Position des mittleren Knotens an und ziehen Sie ihn fest, bis er die MCAO-Naht in Position halten kann. Den Knoten nicht übermäßig festigen. Lösen Sie den oberen Knoten, aber machen Sie einen weiteren lockeren Schlupfknoten an der gleichen Stelle.

Fördern Sie die MCAO-Nähte in die ICA. Bestätigen Sie, dass die MCAO-Naht die Bifurkation in die ICA übergibt. Der Pfad der Naht sollte relativ gerade sein und tiefer in das Gewebe eindringen, während es voranschreitet.

Überprüfen Sie den silbern Marker am Nahtende. Stellen Sie sicher, dass es die Bifurkation erreicht. Überprüfen Sie die Richtung der MCAO-Nähte erneut.

Passen Sie die oberen und mittleren Knoten an, um keine Blutleckszugung zu gewährleisten. Weitere Fortschritte der MCAO Naht, ziehen Sie die beiden oberen Knoten, um die MCAO Naht an Ort und Stelle zu sichern. Beginnen Sie die Aufnahmezeit für eine Stunde Ischämie.

Nach einer Stunde Ischämie befeuchten wir das Tier und öffnen die Hautwunde wieder. Setzen Sie den operationschirurgischen Bereich aus. Suchen Sie obere und mittlere Slipknots.

Lösen Sie den oberen Knoten vorsichtig. Ziehen Sie die MCAO-Nähte vorsichtig heraus, bis das weiße Silikonkautschukteil den mittleren Knoten erreicht. Ziehen Sie den oberen Knoten fest, um die MCAO-Naht an Ort und Stelle zu halten, um Blutungen zu vermeiden.

Lassen Sie den mittleren Slipknot vorsichtig los. Ziehen Sie die MCAO-Nähte heraus, bis ihr Ende den oberen Knoten passiert. Ziehen Sie den oberen Knoten fest.

Platzieren Sie den mittleren Slipknot direkt über dem Schnitt auf dem CCA. Ziehen Sie den mittleren Slipknot an. Entfernen Sie den oberen Knoten.

Trim Nahtenen des mittleren Knotens. Schließen Sie die Hautwunde und lassen Sie das Tier sich erholen. Basierend auf unserer Erfahrung, neuronale Stammzellen sicher durch diese arterielle Route zwischen einem und drei Tagen nach dem Schlaganfall injiziert.

Auch hier gibt es geringfügige Unterschiede zwischen Maus- und Rattenoperationen für die neuronale Stammzellinjektion. Und hier zeigen wir die Mauschirurgie. Am dritten Tag nach dem Schlaganfall, beantieren Sie das Tier, öffnen Sie die Wunde wieder und setzen Sie die CCA wieder frei.

Legen Sie eine doppelsträngige chirurgische Naht unter die CCA und schneiden Sie sie in der Mitte, um zwei Nähte zu erhalten. Legen Sie die beiden Nähte richtig. Machen Sie einen Slipknot mit der oberen Naht.

Platzieren Sie es direkt unter der Bifurkation. Ziehen Sie den oberen Slipknot fest. Machen Sie einen weiteren Slipknot mit der mittleren Naht.

Schneiden Sie einen kleinen Schnitt direkt über dem gestutzten Knoten, der von der Schlaganfalloperation übrig geblieben ist. Schneiden Sie die Spitze des MRE 10 Katheters mit einem Winkel von ca. 45 Grad. Verwenden Sie dieses scharfe Ende, um den Schnitt auf dem CCA einzugeben.

Achten Sie darauf, den Einstiegswinkel und die Kraft, die zum Einsetzen des Katheters verwendet wird, richtig einzustellen. Andernfalls kann der Katheter nicht in das CCA gelangen oder es durchstechen. Legen Sie den Katheter ein und rücken Sie vor, bis die Spitze den oberen Knoten erreicht.

Ziehen Sie den mittleren Slipknot fest, um den Katheter an Ort und Stelle zu halten und keine Blutverbindung zu gewährleisten. Lösen Sie den oberen Knoten. Machen Sie einen Schlupfknoten mit der oberen Naht.

Passen Sie den Winkel des Katheters innerhalb des CCA und die Positionen beider Knoten an, bis ein schneller Blutrückfluss sichtbar ist, was auf eine erfolgreiche Kommunikation zwischen Katheter und CCA-Fluss hindeutet. Starten Sie die Spritzenpumpe. Das Blut im Katheter wird zurück in den CCA gespült.

Beenden Sie die Injektion nach fünf Minuten. Ligate den oberen Knoten. Lösen Sie den mittleren Knoten und ziehen Sie den Katheter zurück.

Ligate den mittleren Knoten. Trimmen Sie alle Knoten. Schließen Sie die Wunde und lassen Sie das Tier sich erholen.

Nach intraarterieller Injektion sind GFP-markierte neuronale Stammzellen meist in der ipsilateralen Hemisphäre zu finden. Hier zeigen wir die Verteilung im Hippocampus Dentate Gyrus an einem Tag nach der Injektion. In der ipsilateralen Hemisphäre, einige der GFP positive neuronale Stammzellen in der Kortex und Striatum lokalisiert, Exprimat Doppelkort, ein Marker von unreifen Neuronen.

Dies sind repräsentative Bilder von Schein- und Schlaganfalltieren mit oder ohne neuronale Stammzellinjektion nach sieben Tagen nach der Injektion. 30 Tage nach der Entbindung kann nur eine geringfügige Autofluoreszenz über den FITC-Kanal bei den Tieren, die eine Fahrzeuginjektion erhalten, nachgewiesen werden. Während in Stammzellen injizierte Tiere, GFP-markierte neuronale Stammzellen können im verletzten Gehirn mit Derexpression von verschiedenen Zellmarkern wie dem Gleo-Marker GFP oder dem neuronalen Marker Tujuan gefunden werden.

Die weißen Pfeile in jedem Bild zeigen neuronale Stammzellen an, die GFP- bzw. Tujuan-Marker exzieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die intraarterielle Injektion eine praktikable Methode zur Abgabe von neuronalen Stammzellen zur Schlaganfalltherapie ist. Neuronale Stammzellen können überleben und sich in verschiedene Zelltypen innerhalb des verletzten Gehirns differenzieren.

Und schließlich kann die hier eingeführte intraarterielle Injektionsmethode auch für die Lieferung von Lösungen und Suspensionen eingesetzt werden.