Livraison intra-artérielle de cellules souches neuronales au cerveau du rat et de la souris : application à l’ischémie cérébrale

L’AVC est la principale cause de mortalité et d’invalidité dans le monde. Bien que la thrombolyse et l’ablation chirurgicale de l’occlusion vasculaire cérébrale puissent être exécutées dans certains patients, il y a toujours un besoin urgent de thérapies efficaces contre l’AVC. Ici, nous démontrons une livraison intra-artérielle à base de cathéter des cellules souches à l’hémisphère ischémique comme régime potentiel pour la thérapie d’AVC.

Tout d’abord, nous introduisons comment préparer le cathéter d’injection et les crochets chirurgicaux. Nous avons conçu deux types de cathéters d’injection pour l’injection intra-artérielle. La conception une est utilisée pour l’injection d’une solution ou d’une suspension qui ne nécessite pas de rinçage du tube.

La conception deux permet l’injection de cellules souches neurales, suivie d’une bouffée d’eau du volume mort pour livrer le volume complet. Pour construire un ensemble de cathéters d’injection, vous aurez besoin d’aiguilles de calibre 26 et 20, d’une longueur de 10 à 15 centimètres de cathéter MRE 25 et de trois centimètres de cathéters MRE 50 et MRE 10. Couper les deux extrémités des aiguilles et polir l’extrémité métallique sur du papier de verre pour rouvrir le tube et lisser les bords, puis rincer à l’eau distillée pour nettoyer l’alésage et laver les débris.

La figure montre une extrémité fermée d’une aiguille de calibre 20 après avoir coupé la pointe de l’aiguille, qui est rouverte avec un alésage lisse après polissage. Au microscope, insérer l’aiguille de calibre 20 dans l’extrémité du tube MRE 50. Pliez l’aiguille de calibre 26, puis pénétrer le tube sous l’extrémité de la pointe de l’aiguille de calibre 20.

Fixez l’aiguille de calibre 26 avec de la colle super. Puis intégrer les deux moyeux aiguille et le tube et époxy pour construire un bloc solide pour améliorer la résistance. Vous aurez également besoin de trois crochets chirurgicaux pour maintenir le tissu en position pour une meilleure exposition des sites chirurgicaux.

Couper un arbre d’aiguille d’un cent et demi à deux centimètres de long à partir d’une aiguille de calibre 27 et polir les deux extrémités sur du papier de verre jusqu’à ce qu’ils soient ternes. Utilisez une petite pince hémostatique pour plier l’arbre dans un crochet à une extrémité et un anneau en forme à l’autre extrémité. Insérez un cathéter MRE 25 de 10 à 15 centimètres de long à travers l’anneau et fixez-le avec du ruban chirurgical clair.

Faire deux crochets de plus en utilisant la même méthode. Les crochets et le système de cathéter doivent être trempés pendant la nuit dans 70 pour cent d’éthanol pour la stérilisation. Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Kentucky.

Nous utilisons le cerveau embryonnaire orl de souris pour la culture GFP, cellules souches neurales positives. Les embryons positifs gfp peuvent être facilement visualisés dans le canal FITC sur un microscope fluorescent. Bien que les embryons de type sauvage ne présentent aucune fluorescence utilisant la même exposition.

L’autofluorescence des embryons de type sauvage n’est visible que lorsque le temps d’exposition est augmenté 100 fois. Le cortex embryonnaire est recueilli et utilisé pour établir des cultures de cellules souches neurales suivant le protocole du fabricant. Ces cellules souches neurales peuvent former des neurosphères et peuvent être le passage sur 10 générations et ils peuvent se différencier en glia sont des neurones.

Le panneau des marqueurs embryonnaires de cellules souches tels que nanog, SSEA1, Oct4 et Sox3 peut être employé pour identifier les propriétés de cellules souches tandis que dans les neurospheres. Les neurosphères ont été cultivés dans les médias, suivant le protocole du fabricant et l’utilisation entre les passages trois et cinq pour la livraison de cellules souches neurales. La course ischémique a été induite dans l’hémisphère gauche pour des souris et des rats, utilisant une occlusion cérébrale moyenne basée sur le filament, MCAO avec quelques modifications selon l’espèce.

Chez la souris, le filament est inséré à travers l’artère carotide commune, CCA et avancé dans l’artère carotide interne, ICA. Tandis que chez les rats, le filament est introduit par l’artère carotide externe, ECA dans l’ICA en raison de l’espace de travail plus grand. Ici, nous démontrons la chirurgie de la souris.

Après avoir fait une incision de midline le long du cou, séparez les tissus sous-jacents utilisant la dissection émoussée. Utilisez les trois crochets microchirurgaux fabriqués à partir d’arbres à aiguilles de calibre 27 pour obtenir un meilleur champ visuel. Le carré noir indique la zone chirurgicale pour l’étape suivante.

La couche musculaire au-dessus du CCA gauche est soigneusement ouverte pour exposer le CCA gauche et le nerf vague. Suivez le CCA jusqu’à ce que vous atteigniez et identifiez la bifurcation. Il faut faire preuve de prudence pour ne pas étirer, déplacer ou presser ce CCA ou ce nerf vague.

Ouvrez soigneusement le tissu conjonctif clair, couvrant le CCA et le nerf vague. Libérez l’espace sous ce CCA avec une pointe des forceps et isolez autant que possible la tige cca. Enfilez une suture chirurgicale en nylon tressée o à double brin sous le CCA.

Couper le point médian pour laisser aux sutures sous-jacentes à la CCA. Placez une autre suture en nylon sous le CCA. Attachez un slipknot sur la suture supérieure, en le gardant lâche.

Séparez les deux sutures inférieures. Attachez un nœud de glissement avec la suture du milieu, en la gardant lâche pour l’instant. Attachez le nœud d’un chirurgien avec une suture inférieure et déplacez-le à l’extrémité proximale autant que possible.

Couper les extrémités de la suture. Exposez davantage le CCA au-delà de la bifurcation. Poussez le slipknot lâche supérieur à la bifurcation et serrez-le pour empêcher le flux arrière du sang.

Mentez la suture mcao en caoutchouc de silicium enduite de 70 nylon à côté de la CCA. À l’aide de micro ciseaux, couper une petite incision sur le CCA, à côté du nœud inférieur. Insérez la pointe de la suture mcao dans le CCA par cette incision et avancez-la au noeud supérieur.

Ajustez la position du nœud moyen et serrez-la jusqu’à ce qu’elle puisse maintenir la suture MCAO en position. Ne serrez pas excessivement le nœud. Relâchez le nœud supérieur, mais faites un autre nœud de glissement lâche au même endroit.

Avancez la suture mcao dans l’ICA. Confirmez que la suture mcao passe la bifurcation dans l’ICA. Le chemin de la suture doit être relativement droit, entrant plus profondément dans le tissu au fur et à mesure qu’il avance.

Vérifiez le marqueur argenté sur l’extrémité de suture. Assurez-vous qu’il atteint la bifurcation. Vérifiez à nouveau la direction de la suture mcao.

Ajustez les nœuds supérieurs et moyens pour vous assurer qu’il n’y a pas de fuite de sang. Avancez davantage la suture mcao, serrez les deux nœuds supérieurs pour fixer la suture MCAO en place. Commencez à enregistrer le temps pendant une heure d’ischémie.

Après une heure d’ischémie, nous anesthésions l’animal et rouvrons la plaie cutanée. Exposez la zone chirurgicale. Localisez les glissades supérieures et moyennes.

Relâchez doucement le nœud supérieur. Retirez doucement la suture MCAO jusqu’à ce que la partie en caoutchouc de silicone blanc atteigne le nœud moyen. Serrer le nœud supérieur pour maintenir la suture MCAO en place pour éviter les saignements.

Relâchez doucement le slipknot du milieu. Retirez la suture MCAO jusqu’à ce que son extrémité passe le nœud supérieur. Serrer le nœud supérieur.

Placez le slipknot du milieu juste au-dessus de l’incision sur le CCA. Serrer le slipknot du milieu. Retirer le nœud supérieur.

Couper les extrémités de suture du nœud moyen. Fermez la plaie de la peau et laissez l’animal récupérer. D’après notre expérience, les cellules souches neurales se sont injectées en toute sécurité par cette voie artérielle entre un et trois jours après l’AVC.

Encore une fois, il existe des variations mineures entre les chirurgies de souris et de rats pour l’injection de cellules souches neurales. Et ici, nous démontrons la chirurgie de la souris. Le troisième jour après l’AVC, anesthésier l’animal, rouvrir la plaie et dénoncer à nouveau le CCA.

Déposer une suture chirurgicale à double brin sous le CCA et la couper au milieu pour obtenir deux sutures. Placez les deux sutures correctement. Faire un slipknot avec la suture supérieure.

Placez-le juste en dessous de la bifurcation. Serrer le slipknot supérieur. Faire un autre slipknot avec la suture du milieu.

Couper une petite incision juste au-dessus du nœud coupé restant de la chirurgie de l’AVC. Couper la pointe du cathéter MRE 10 avec un angle d’environ 45 degrés. Utilisez cette extrémité pointue pour entrer dans l’incision sur le CCA.

Veillez à ajuster correctement l’angle d’entrée et la force utilisée pour insérer le cathéter. Dans le cas contraire, le cathéter peut ne pas entrer dans le CCA ou peut le percer. Insérer le cathéter et avancer jusqu’à ce que la pointe atteigne le nœud supérieur.

Serrez le slipknot moyen pour maintenir le cathéter en place et assurez-vous qu’il n’y a pas de lien sanguin. Relâchez le nœud supérieur. Faire un nœud de glissement avec la suture supérieure.

Ajustez l’angle du cathéter à l’intérieur du CCA et les positions des deux nœuds jusqu’à ce qu’un flux rapide de sang soit visible, ce qui indique une communication réussie entre le cathéter et le débit du CCA. Démarrez la pompe à seringues. Le sang dans le cathéter sera rincé de nouveau dans le CCA.

Mettre fin à l’injection après cinq minutes. Ligate le noeud supérieur. Relâchez le nœud moyen et retirez le cathéter.

Ligate le noeud du milieu. Couper tous les nœuds. Fermez la plaie et laissez l’animal récupérer.

Après injection intra-artérielle, les cellules souches neurales étiquetées GFP se trouvent principalement dans l’hémisphère ipsilateral. Ici, nous montrons la distribution dans le gyrus dentate hippocampal à un jour après injection. Dans l’hémisphère ipsilateral, certaines des cellules souches neurales positives de GFP localisées dans le cortex et le striatum, expriment la double cort, un marqueur des neurones immatures.

Ce sont des images représentatives d’animaux de feinte et d’AVC avec ou sans injection de cellules souches neurales à sept jours après l’injection. À 30 jours après l’accouchement, seule une fluorescence automatique mineure peut être détectée par le canal fitc chez les animaux qui reçoivent l’injection du véhicule. Tandis que dans les animaux injectés de cellules souches, les cellules souches neurales étiquetées de GFP peuvent être trouvées dans le cerveau blessé avec l’expression de divers marqueurs cellulaires comme le marqueur de gleo GFP ou le tujuan neuronal de marqueur.

Les flèches blanches de chaque image indiquent des cellules souches neurales exprimant respectivement des marqueurs GFP ou tujuan. En conclusion, l’injection intra-artérielle est une méthode faisable pour la livraison des cellules souches neurales pour la thérapie d’AVC. Les cellules souches neurales peuvent survivre et se différencier en différents types de cellules dans le cerveau blessé.

Enfin, la méthode d’injection intra-artérielle introduite ici peut également être utilisée pour la livraison de solutions et de suspensions.