このプロトコルを使用して、フィロスフィア内で微生物がどのように組み立てられ、相互作用するかに関する重要な質問に対処することができます。滅菌野菜抽出物を使用することで、植物発酵中の機能にフィロ球群の構造をリンクすることができるという付加的な利点があります。これらの技術により、科学者は微生物がフィロ球体でどのように相互作用するかをテストし、これらのフィロ球群が発酵にどのような影響を与えるかを追跡することができます。
キャベツの種子を表面化するには、1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに100種を入れることから始めます。70%エタノールの1ミリリットルをチューブに加え、5分間渦を出します。その後、ピペットを使用してエタノールを廃棄します。
50%漂白剤の1ミリリットルを追加し、5分間チューブを渦に入れ、漂白剤を捨てます。種子を4回リンスし、チューブを渦出させるオートクレーブ脱イオン水を1ミリリットル加えて、水を捨てる。最後のすすめの後、殺菌した脱イオン水に種子を2〜8時間浸し、植える前に種子コートを柔らかくします。
10グラムのきれいなカルシウム粘土を15%2.5センチメートルのガラス管に計量する。カルシウム粘土を覆うために、各チューブに調製したMS Brothの約9ミリリットルを追加します。ガラス管を22ミリメートルの双方向試験管キャップでゆるやかにキャップします。
チューブを摂氏121度で60分間オートクレーブします。オートクレーブからチューブを取り外すときは、キャップをガラス管に押し込んで密閉し、使用前にチューブを室温まで冷却します。チューブが冷却されたら、余分な長い鉗子を使用して、各チューブの中央に1つの無菌キャベツの種を穏やかに配置します。
7ウェイトレイでチューブをレースし、24°Cで16時間のライトサイクルを備えたライトラックの下にトレイを置きます。種子は、コチルドンが形成された後の最初の血管葉である5日後に最初の真の葉を開発します。それはしわの端を有し、トリコームで覆われている。
無菌キャベツの無菌性をテストするには、植物の基部を滅菌鉗子で軽く握り、引き出します。チューブからキャベツを完全に取り除く前に、滅菌解剖はさみで根を慎重に切り落としてください。次にキャベツの葉を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに圧縮します。
各マイクロ遠心分離管にPBSの400マイクロリットルを追加し、キャベツを均質化するために無菌マイクロ害虫を使用しています。キャベツのブレード100マイクロリットルは寒天プレートにホモジュネイトし、広いオリフィスピペットチップを使用することを確認します。接種株のグリセロールストックを作るには、個々のコロニーを同じ培地の2つまたは3つの新しいプレートにそっと引き出す。
コロニーを2〜5日間行き、プレートから15%グリセロールの15ミリリットルの円錐管に削ります。チューブを完全に混ぜ合わせます。混合グリセロールストックの1ミリリットルをマイクロ遠心管にアリコートし、残りの14ミリリットルのグリセロールストックと一緒に使用する準備ができるまで摂氏80度を貯蔵する。
使用の1週間前に、氷の上に1ミリリットルのアリコートを解凍し、接種ストックの濃度を決定するためにいくつかの異なる希釈液にそれを置きます。キャベツを接種する準備ができたら、グリセロールストックを氷上で解凍し、所望の濃度に希釈します。希釈ストックの10ミリリットルを無菌ポンプボトルに加え、5つのスプレーを大きな廃棄物回収ビーカーに送り込みます。
キャベツチューブから蓋を取り出し、キャベツをスプレーボトルに向かって傾けます。各キャベツに3つのポンプを接種液でスプレーし、キャベツのサブセットを収穫して実際のインプット接種濃度を評価する。キャベツを収穫するには、殺菌された鉗子でチューブから取り出します。
無菌解剖はさみで根を切り落とし、慎重に事前に計量された無菌マイクロ遠心分離チューブに入れなさい。今後の計算のためにキャベツの重量を記録します。キャベツで各チューブに400マイクロリットルのPBSを加え、マイクロペスルで30回粉砕し、広いオリフィスピペットチップを使用してキャベツホモジュネートをプレートします。
キャベツの最も外側の葉を取り除いて捨て、残りのキャベツをすべてブレンダーに収めるためにみじん切りにします。細かいパルプにブレンドし、キャベツのホモジネートの重量を量ります。キャベツ1グラムあたり2ミリリットルの蒸留水を加えます。
次に、キャベツスラリーをバスケットコーヒーフィルターの2層で濾過します。スラリーを遠心管に分配し、20,000倍のGで20分間、または大きな粒子が溶液から落ち着くまで遠心分離します。上清を取り除き、ペレットキャベツの破片を邪魔しないように注意してください。
標準的な塩濃度で発酵条件を再現するには、その抽出物に塩化ナトリウムの体積に2%の重量を加えます。真空に取り付けられた0.2マイクロメートルのフィルターで野菜エキスをビルダーし、滅菌チューブに分配し、マイナス80度で凍結します。種子滅菌法は、いくつかのナパキャベツで試験され、それらはすべて同様の成長率を実証した。
しかし、他の種のブラッシカは、植物が殺菌後に発芽率が低いか、茎が急速に伸びてスピン異常な植物を作るために伸びていたので、限られた成功を収めました。微生物分離株は、単一株分離物として、または別の単離株と組み合わせて接種した。各治療について合計15個の無菌キャベツを試験し、接種後4日または10日後にすぐに収穫した。
この分離株はナパキャベツフィロスフィアで急速な成長を示した。2つの酵母と3つの細菌を3種類の無菌野菜抽出物または赤、緑、ナパキャベツから作られたSVEに接種した。接種物の成長は、MRSまたはYPD寒天プレート上の各処理の5マイクロリットルをスポットメッキすることによって14日間にわたって記録した。
発酵中のpHの測定は、乳酸菌がSVEをpH4以下のレベルまで酸性化できることを示し、消費しても安全な発酵を示した。これらの方法は、特にキャベツマイクロバイオームに適用されているが、他の植物システムで有用である可能性があります。システムを無菌に保つのは難しいかもしれませんが、私たちのアウトラインプロトコルは詳細ですが、各ステップが重要であることがわかりました。
