이 프로토콜을 사용하여, 우리는 미생물이 필로스피어에서 조립하고 상호 작용하는 방법에 관한 중요한 질문을 해결할 수 있습니다. 멸균 식물성 추출물을 사용함으로써 필로 구계 공동체의 구조를 식물성 발효 시 기능에 연결할 수 있다는 장점이 있습니다. 이러한 기술을 통해 과학자들은 미생물이 필로 구체에서 상호 작용하는 방법을 테스트한 다음 이러한 필로 구계 공동체가 발효에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 추적할 수 있습니다.
양배추 씨앗을 살균하기 위해 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리튜브에 100 개의 씨앗을 배치하여 시작합니다. 튜브에 70%에탄올 1밀리리터를 넣고 5분간 소용돌이를 피하십시오. 그런 다음 파이펫을 사용하여 에탄올을 버립니다.
50%의 표백제 1밀리리터를 넣고 튜브를 5분간 소용돌이치게 한 다음 표백제를 버립니다. 튜브를 소용돌이게 하는 오토클레이온 화된 물의 1밀리리터를 첨가한 다음 물을 버린 다음 씨앗을 4번 헹구십시오. 마지막 헹구기 후, 씨앗을 살균 된 탈온 물에 2 ~ 8 시간 동안 담그고 심기 전에 씨앗 털을 부드럽게하십시오.
깨끗한 칼슘 점토 10그램을 15x 2.5센티미터 유리 튜브에 넣습니다. 각 튜브에 약 9밀리리터의 MS 국물을 첨가하여 칼슘 점토를 덮습니다. 유리 튜브를 22mm 양방향 테스트 튜브 캡으로 느슨하게 캡.
60 분 동안 121 섭씨에서 튜브를 자동 클로 브. 오토클레이브에서 튜브를 제거할 때 캡을 유리 튜브에 밀어 밀봉한 다음 튜브를 실온으로 식힙니다. 튜브가 냉각되었을 때, 여분의 긴 집게를 사용하여 멸균 양배추 씨앗 1 개를 각 튜브의 중앙에 부드럽게 배치했습니다.
튜브를 7방향 트레이로 레이스하고 트레이를 16시간 광사이클로 24도로 가벼운 랙 아래에 놓습니다. 씨앗은 5 일 후에 그들의 첫번째 진정한 잎을 개발할 것입니다, cotyledons가 형성된 후에 첫번째 혈관 잎입니다. 그것은 주름 가장자리가 있으며 tricombs로 덮여 있습니다.
세균이 없는 양배추를 멸균을 테스트하려면 멸균 된 집게로 식물의 베이스를 부드럽게 잡고 꺼냅니다. 튜브에서 양배추를 완전히 제거하기 전에 살균 된 해부 가위로 뿌리를 조심스럽게 잘라냅니다. 그런 다음 양배추 잎을 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 압축합니다.
각 마이크로 원심분리기 튜브에 PBS 400 마이크로리터를 추가하고 멸균 마이크로 유봉을 사용하여 양배추를 균질화합니다. 양배추의 블레이드 100 마이크로리터는 한천 판에 균일하게 되어 넓은 오리피스 파이펫 팁을 사용하십시오. 분이 하는 균주의 글리세롤 주식을 만들기 위해 개별 식민지를 동일한 미디어의 2개 또는 세 개의 새로운 플레이트에 부드럽게 줄입니다.
2~5일 동안 식민지를 적어 15%의 글리세롤15밀리리터가 있는 15밀리리터 원내 튜브로 플레이트에서 긁어냅니다. 튜브를 완전히 소용돌이로 섞습니다. Aliquot 는 혼합 글리세롤 스톡의 밀리리터를 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 나머지 14밀리리터의 글리세롤 스톡과 함께 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 80도를 저장합니다.
사용하기 1 주일 전에, 얼음에 1 밀리리터 알리쿼트를 해동하고 접종 주식의 농도를 결정하기 위해 여러 가지 다른 희석에 배치합니다. 양배추를 접종할 준비가 되면 글리세롤 스톡을 얼음 위에 해동하여 원하는 농도로 희석합니다. 희석된 육수 10밀리리터를 멸균 펌프 병에 넣고 5개의 스프레이를 대형 폐기물 수거 비커에 넣습니다.
양배추 튜브에서 뚜껑을 제거하고 양배추를 스프레이 병쪽으로 기울입니다. 접종 용액의 세 펌프로 각 양배추를 분사한 다음 양배추의 하위 집합을 수확하여 실제 입력 접종 농도를 평가합니다. 양배추를 수확하려면 살균 된 집게로 튜브에서 제거하십시오.
멸균 해부 가위로 뿌리를 잘라 내고 미리 계량된 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 조심스럽게 배치하십시오. 향후 계산을 위해 양배추의 무게를 기록합니다. 양배추로 각 튜브에 400 마이크로리터를 넣고 마이크로 유봉으로 30회 갈아서 넓은 오리피스 파이펫 팁을 사용하여 양배추 균질을 플레이트합니다.
양배추의 가장 바깥쪽 잎을 제거하고 버리고 남은 양배추를 모두 믹서기에 넣습니다. 미세 한 펄프에 혼합하고 양배추 균형을 무게. 양배추 1그램당 증류수 2밀리리터를 넣습니다.
그런 다음 양배추 슬러리를 바구니 커피 필터의 두 층을 통해 필터링합니다. 슬러리를 원심분리기 튜브에 분배하고 원심분리기를 20분, 000배 G로 분배하거나 큰 입자가 용액에서 빠져나올 때까지 분배합니다. 펠릿 양배추 파편을 방해하지 않도록주의, 상체를 제거합니다.
표준 염분 농도로 발효 조건을 재현하려면 추출물에 염화 나트륨의 부피에 2%의 무게를 추가합니다. 0.2 마이크로미터 필터가 진공에 부착된 채소 추출물을 멸균 튜브에 분배하고 영하 80도에서 동결합니다. 종자 살균 방법은 여러 나파 양배추로 테스트되었고 모두 비슷한 성장속도를 보였습니다.
그러나, 브라시카의 다른 종은 식물이 살균 후 낮은 발아율을 가지고 있거나 줄기가 빠르게 길어질 때 가설건강에 해로운 식물을 만들기 때문에 제한된 성공을 주었습니다. 미생물 분리는 단일 균주 분리또는 다른 격리와 함께 접종하였다. 총 15개의 세균이 없는 양배추는 각 처리를 위해 시험되고 접종 후에 4 일 또는 10 일에 즉시 수확되었습니다.
격리는 나파 양배추 필로스피어에서 급속한 성장을 입증했다. 2개의 효모와 3개의 박테리아는 빨강, 녹색 및 나파 양배추로 만든 멸균 야채 추출물 또는 SVE의 3개의 다른 모형으로 접종되었습니다. 접종의 성장은 각 치료의 5 마이크로리터를 MRS 또는 YPD 천판에 반점하여 14일 이상 기록되었다.
발효 전반에 걸친 pH측정은 유산균이 SVE를 pH 4 이하 수준으로 산화할 수 있는 것으로 나타났으며, 이는 소비에 안전한 발효를 나타낸다. 이러한 방법은 양배추 미생물군유전체에 특별히 적용되었지만 다른 식물 시스템에서 유용할 수 있습니다. 시스템 멸균을 유지하는 것은 어려울 수 있으며, 윤곽 프로토콜은 상세하지만 각 단계가 중요하다는 것을 발견했습니다.
