Usando este protocolo, podemos abordar questões-chave sobre como os micróbios se reúnem e interagem na filosfera. Tem o benefício adicional de que, usando o extrato vegetal estéril, podemos vincular a estrutura das comunidades da esfera phyllo à sua função durante a fermentação vegetal. Essas técnicas permitem que os cientistas testem como micróbios interagem na esfera phyllo e, em seguida, rastreiem como essas comunidades da esfera filo podem impactar a fermentação.
Para esterilizar a superfície das sementes de repolho, comece colocando 100 sementes em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro. Adicione um mililitro de 70% de etanol ao tubo e vórtice por cinco minutos. Em seguida, use uma pipeta para descartar o etanol.
Adicione um mililitro de 50% de alvejante e vórtice do tubo por cinco minutos e, em seguida, descarte o alvejante. Enxágüe as sementes quatro vezes, adicionando um mililitro de água desionizada autoclavada vórtice do tubo, depois descartando a água. Após a última lavagem, mergulhe as sementes em água deionizada esterilizada por duas a oito horas para suavizar o casaco de sementes antes do plantio.
Pesar 10 gramas de argila de cálcio limpa em um tubo de vidro de 15 por 2,5 centímetros. Adicione aproximadamente nove mililitros de Caldo MS preparado a cada tubo para cobrir a argila de cálcio. Tampar livremente os tubos de vidro com tampas de tubo de ensaio de 22 milímetros de duas vias.
Autoclave os tubos a 121 graus Celsius por 60 minutos. Ao remover os tubos da autoclave, empurre as tampas para os tubos de vidro para selá-los e, em seguida, esfrie os tubos à temperatura ambiente antes de usar. Quando os tubos tiverem esfriado, usem fórceps extra longos para colocar suavemente uma semente de repolho estéril no centro de cada tubo.
Amarre os tubos em uma bandeja de sete vias e coloque a bandeja sob racks de luz com um ciclo de luz de 16 horas a 24 graus Celsius. As sementes desenvolverão sua primeira folha verdadeira após cinco dias, que é a primeira folha vascular após a formação dos cotilledons. Tem uma borda enrugada e está coberta de tricombs.
Para testar o repolho sem germes para esterilidade, segure suavemente a base da planta com fórceps esterilizados e puxe-a para fora. Antes de remover totalmente o repolho do tubo, corte cuidadosamente as raízes com uma tesoura de dissecção esterilizada. Em seguida, compacte as folhas de repolho em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro.
Adicione 400 microliters de PBS a cada tubo de micro centrífuga e use um micro pilão estéril para homogeneizar o repolho. Lâmina 100 microliters do repolho homogeneizam em placas de ágar, certificando-se de usar uma ponta de pipeta de orifício largo. Para fazer estoques de glicerol de cepas inoculando, suavemente listrar colônias individuais em duas ou três novas placas da mesma mídia.
Remar as colônias por dois a cinco dias, depois raspá-las das placas em um tubo cônico de 15 mililitros com 15 mililitros de 15% de glicerol. Vórtice o tubo completamente para misturar. Aliquot um mililitro do estoque de glicerol misto em um tubo de micro centrífuga e armazene-o 80 graus Celsius até estar pronto para usar junto com os 14 mililitros restantes de estoque de glicerol.
Uma semana antes do uso, descongele a alíquota de um mililitro no gelo e coloque-a em várias diluições diferentes para determinar a concentração do estoque de inoculação. Quando estiver pronto para inocular o repolho, descongele o caldo de glicerol no gelo e dilui-o à concentração desejada. Adicione 10 mililitros do estoque diluído à garrafa de bomba estéril e bombeie cinco sprays em um grande béquer de coleta de lixo.
Retire a tampa do tubo de repolho e incline o repolho em direção à garrafa de spray. Pulverize cada repolho com três bombas da solução de inoculação e, em seguida, colher um subconjunto dos repolhos para avaliar a concentração real de inoculação de entrada. Para colher o repolho, remova-o do tubo com fórceps esterilizados.
Corte as raízes com uma tesoura de dissecção estéril e coloque-a cuidadosamente em um tubo de micro centrífuga estéril pré-pesado. Registo o peso do repolho para cálculos futuros. Adicione 400 microliters de PBS a cada tubo com o repolho e moa-o 30 vezes com um micro pilão, em seguida, aplaque o repolho homogeneizar usando pontas de pipeta de orifício largo.
Retire e descarte as folhas mais externas do repolho e corte todo o repolho restante para caber em um liquidificador. Misture-o a uma polpa fina e pese o repolho homogeneado. Adicione dois mililitros de água destilada por grama de repolho.
Em seguida, filtre o chorume de repolho através de duas camadas de filtros de café da cesta. Distribua o chorume em tubos de centrífuga e centrífuga-o a 20.000 vezes G por 20 minutos ou até que grandes partículas se acalmem fora da solução. Remova o supernatante, tomando cuidado para não perturbar os detritos de repolho pelleted.
Para recriar as condições de fermentação com concentrações de sal padrão, adicione 2% de peso ao cloreto de sódio de volume ao extrato. Bilder o extrato vegetal com um filtro de 0,2 micrômetro ligado a um vácuo, dispensá-lo em tubos estéreis e congelá-lo a menos 80 graus Celsius. O método de esterilização de sementes foi testado com vários repolhos Napa e todos eles demonstraram taxas de crescimento semelhantes.
No entanto, outras espécies de brassica tiveram sucesso limitado porque as plantas tiveram baixas taxas de germinação após a esterilização ou o caule alongou rapidamente para fazer uma planta espinhosamente insalubre. Os isolados microbianos foram inoculados tanto como isolados de cepa únicas quanto em combinação com outro isolado. Um total de 15 repolhos sem germes foram testados para cada tratamento e colhidos imediatamente, em quatro dias ou em 10 dias após a inoculação.
Os isolados demonstraram rápido crescimento na Filosphere de repolho napa. Duas leveduras e três bactérias foram inoculadas em três tipos diferentes de extrato vegetal estéril ou SVE feito de repolho vermelho, verde e napa. O crescimento dos inoculados foi registrado ao longo de 14 dias por meio de um revestimento de cinco microliters de cada tratamento em placas de ágar MRS ou YPD.
Medições de pH ao longo da fermentação mostraram que as bactérias do ácido láctico eram capazes de acidificar a SVE a níveis abaixo do pH quatro, indicando um fermento seguro para o consumo. Esses métodos foram aplicados especificamente ao microbioma de repolho, mas podem ser úteis em outros sistemas vegetais. Pode ser desafiador manter o sistema estéril, nossos protocolos de contorno são detalhados, mas achamos cada passo importante.
