Name: establishment of an extracellular acidic ph culture system
Uploaded: 2017-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
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東京大学先端研、医学システム生物学、ゲノム科学部門と研究室のメンバーに感謝します我々 は特に感謝博士 h. 油谷、小玉徹博士、(LSBM、東大先端研、東京大学)、A 博士、博士・吉田先生・ k ・富塚 有用な議論とサポートの國里 (協和発酵キリン株式会社)。この作品は一部文部の若い科学者 (A) (26710005、ティー ・ オーエンタテインメント)、革新的な領域 (H 01567、ティー ・ オーエンタテインメントの 26116711 と 16) 科学研究費補助金・挑戦 文部科学省がん研究事業がん研究 (ティー ・ オーエンタテインメント)、小林財団、武田科学振興財団 (ティー ・ オーエンタテインメント) 日本の技術からの探索的研究 (16 K 14605、ティー ・ オーエンタテインメント) と(P 作成) 治療の進化とアメッド (ティー ・ オーエンタテインメント) 総合医療研究機構から革新的ながん対策の実践的研究。

1. 酸性の培地の準備
<ol><li>
コントロール (pH 7.4) の作製と低 pH (ペーハー 6.8) 培
	<ol>
<li>500 mL の水に L-グルタミンなし DMEM 粉末 4.75 g を溶解します。</li>
		<li>耐圧ボトルで 0.33 M NaHCO3ソリューションを準備します。 注意: NaHCO3 CO2ガスを加熱すると熱分解を発するので圧力のタイトなボトルを使用することが重要です。</li>
		<li>オートクレーブ媒体およびソリューション。25 ° C に冷却するこれらのバッファーを許可します。</li>
		<li>200 mM L-グルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシンの 5 mL の 5 mL を加えると炭酸なし DMEM の 500 mL に牛胎児血清の 50 mL。</li>
		<li>コントロール (pH 7.4) 中 2.4 mL 炭酸なし DMEM の 100 mL あたり 0.33 M NaHCO3ソリューションを追加します。低 pH (ペーハー 6.8) 中炭酸なし DMEM の 100 mL あたり 0.33 M NaHCO3溶液 0.6 mL を追加します。</li>
		<li>37 ° C で 24 時間後 5% 以下の培地の pH をチェック CO2。 注: NaHCO3溶液の量は、インキュベーターと空気圧の CO2の含有量によって異なることが培地の pH に応じて調整する必要があります。理想的には、初めて、DMEM に追加する NaHCO3ソリューションの適切な量を決定する重炭酸塩濃度と培地の pH を測定することをお勧めします。<ol>
<li>CO2インキュベーターから培養皿を削除した直後に培養液を収集し、pH 計を用いて pH を測定します。必要に応じて水浴を使用して 37 ° C で中の温度を保ちます。測定培地の pH 3 回独立。 注: NaHCO3ソリューションは 4 ° C で保存する必要があります、各メディアが新たに作成される必要があります。本研究で使用できる市販の製品は、材料のテーブルに表示されます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
乳酸誘導または HCl による酸性培養培地の準備
	<ol>
<li>(1.1.5 の手順で準備) 制御媒体の 100 mL に乳酸溶液の 74 μ L または 1 M HCl の 125 μ L を追加します。</li>
		<li>37 ° C で 24 時間後 5% 以下の培地の pH をチェック CO2。 注: 乳酸または塩酸溶液の量はまたインキュベーターと空気圧で CO2コンテンツによって異なることが培地の pH に応じて調整する必要があります。理想的には、シリアルの乳酸や媒体の目的の pH に調整するための適切な量を決定する塩酸濃度と培地の pH を測定することをお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 収穫とセルを扱う
<ol><li>37 ° C 未満 5% CO2を実行する前に、少なくとも 1 週間の実験で細胞の育成を開始します。 注: この研究で使用される細胞は、材料表に表示されます。</li>
	<li>70-90% の confluency に到達するときにセルを通過。コンフルエントになるため細胞を認めない。毎日培養中に 2-3 日毎に媒体を変更します。</li>
	<li>5 mL の PBS を追加することによって、細胞を洗います。PBS を吸引し、1 mL のトリプシンなど脱着酵素を追加します。</li>
	<li>セル丸められますをデタッチする開始になるまでは、37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>剥離細胞に培養液 5 mL を追加し、酵素を非アクティブ化します。15 mL チューブ 300 x g 吸引上清に 3 分間遠心し、細胞懸濁液を転送、再培養培地で細胞を中断します。</li>
	<li>検定とトリパン ブルーを使用して実行可能なセルを数えます。</li>
	<li>種 5.0 × 105セル/10 mL の培地に 10 センチメートルの皿の井戸。37 ° C 未満 5% で 24 時間細胞をインキュベート CO2。</li>
	<li>培養培地を吸引、5 ml の PBS、細胞を洗浄し、セクション 1 で作製した酸性培地の 10 mL を加えます。37 ° C 未満 5% で 24 時間細胞をインキュベート CO2。</li>
</ol>3. RNA の隔離
<ol><li>培地を吸引し、5 ml の PBS セルを洗ってください。RNA 抽出試薬を追加してセルを破壊 (教材の一覧表を参照してください)。</li>
	<li>料理を簡単にこすり、ピペットと RNA 抽出試薬を削除し、RNA 抽出試薬/細胞ライセートを 1.5 mL チューブを入金します。5 分間室温に置いたまま。</li>
	<li>250 μ L のクロロホルムを加え、5 分間室温で約 15 米残すと ≥8、5 分 000 × g で遠心管を積極的に振る。</li>
	<li>ピペットを使用して水相を慎重に取り外します。水様段階のいくつかの後ろに残します。別 1.5 mL チューブに配置します。</li>
	<li>水相に 550 μ L のイソプロパノールを加え、軽く混ぜます。室温で 5 分間遠心分離機 (≥20, 000 x g) 最大速度、4 ° C で 20 分を残してください。</li>
	<li>イソプロパノールを注ぐし、1 mL 75% エタノール DEPC 処理水を追加します。優しく混ぜます。5 分間 8,000 × g で遠心分離機します。</li>
	<li>ペレットが空気乾燥させエタノールをピペットします。</li>
	<li>RNA ペレットを約 15-25 μ (収量) に応じて DEPC 処理水を追加します。ミックス徹底的。</li>
	<li>260 で外径を測定することによって隔離された RNA 濃度を測定分光光度計を用いた nm。</li>
</ol>4. cDNA 合成
<ol><li>PCR の反作用の管の次のコンポーネントを組み合わせて: 最大 5 μ g 総 RNA オリゴ dT 1 μ L (50 μ M) やランダム プライマー ミックス (60 μ M)、1 μ L 10 mM dNTP、ヌクレアーゼ フリー水 14 μ L の容量を。</li>
	<li>ミックスし、簡単に小さなベンチトップ遠心分離機を使用してコンポーネントを遠心分離機 (~ 5 s)。65 ° C で 5 分間サンプル RNA のプライマーを変化させなさい。簡単にスピン (~ 5 s) 遠心し、少なくとも 1 分間氷の上速やかにサンプルを置く小さな卓上型を使用します。</li>
	<li>次のコンポーネントを追加: 4 μ L 5 x を逆転写バッファー、1 μ L 逆転写酵素 (200 U/μ L)、1 μ L RNase 阻害剤 (40 U/μ L)。 注: 市販キットの例は材料表のとおり
</li>
	<li>チューブをキャップ ミックス、および卓上型小型遠心分離機を使用してコンテンツを簡単に遠心分離機 (~ 5 s)。10 分間で 50-55 ° C 複合反応混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>10 分の 80 ° c の孵化によって反応を不活性化します。</li>
</ol>5. リアルタイム PCR を用いた酸応答性遺伝子発現の測定
<ol><li>384 ウェル反応板の次のコンポーネントを組み合わせて: 1 μ L テンプレート cDNA、0.75 μ 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine、前方に 0.3 μ L 50 μ Mプライマー、0.3 μ L 50 μ M 逆プライマー、1 μ L の Taq のポリメラーゼ、Taq ポリメラーゼ バッファーの μ L の 20 mM dNTP、16.65 μ L 水の 2.5 x 2.5 μ L 10。 注:テーブルの材料に市販のキットの例を示します。プライマーの一覧を表 1に示します。96 ウェル リアクション プレートをこのステップで使用もできます。(例えば、Taqman プローブ) 他のプローブも使用できます。</li>
	<li>実験およびリアルタイム PCR システムに次の PCR プログラムを設定: 2 分、1 サイクルは 50 ° C95 ° C、10 分、1 サイクル95 ° C 15 s の 60 ° C 1 分、40 サイクル95 ° C、15 s、1 サイクル60 ° C で 15 秒、1 サイクル95 ° C、15 s、1 サイクル。</li>
	<li>QPCR 測定器でプレートを配置します。プログラムを起動します。 注: IDI1 INSIG1、pH 応答性遺伝子MSMO1の発現タンパク質レベルで測定できます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+metabolism:+Warburg+and+beyond.">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li><li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue:+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer.">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li><li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis?.">Why do cancers have high aerobic glycolysis?.</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li><li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH.">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li><li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane.">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752 (2015).</li><li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation.">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers.">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).</li><li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression.">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li></ol>

著者綾乃近藤は協和発酵キリン株式会社の従業員

ここでは、簡単な酸性 pH 文化システムとその評価プロセスについて説明しました。中程度の酸性化、すなわち、減らされた重炭酸濃度、乳酸添加と HCl 添加の 3 つの方法の組み合わせでは、pH 応答メカニズムを徹底的に調査し、他の腫瘍に対する細胞の反応を比較できました。低酸素や栄養飢餓などアイソレータケージ条件。
このメソッドのキーは、培養液中の?...

腫瘍微小環境は、腫瘍の進行と癌細胞代謝1,2,3で重要な役割を果たしています。がん細胞が低酸素血症、栄養不足、酸性細胞外 pH (pHe) など条件にさらされること。ただし、腫瘍の進行の pHe の役割は明らかにされていないとして広く低酸素や栄養飢餓のように。腫瘍組織内 pHe を酸性、およそ pH 6.84,5に到達になることができます。酸性の pH はプロトン (H+) の好気性と嫌気性解糖系の排泄から発生し、増殖癌による乳酸細胞5,6.
最近の研究で明らかに酸性 pHe 誘起ヒストン脱アセチル化、脂肪酸酸化、酸性リソソーム酸性厳しい7,8,9,10への適応のための放出。しかし、どの細胞の酸性化を通じたメカニズム、がん行動と酸性 pH 腫瘍微小環境における規制当局が完全に決定されていないキーの id。さらに、いくつかのレポートの重炭酸塩、トリス、パイプ、および HEPES バッファーまたは乳酸と HCl、不明瞭な濃度を使用して様々 な酸性 pH メディアが中も包括的な調整後の安定性を示す報告は少ないいくつかの異なる酸性培地7,8,9,10の比較
主調整装置と細胞の酸性化のコンテキストでがん細胞の代謝変化を解明するには、酸性 pHe を維持するために単純な体外培養モデルを設立しを癌細胞11pHe の役割を検討しました。37 ° C 未満 5%、6.8 の pHe と酸性培を維持してこのメソッドを使用すると、CO2培養液の減少の重炭酸濃度を使用しています。pH 7.4 は、通常どおりに使用され、媒体を制御します。培地の pH は、少なくとも 24 時間持続され、72 h PANC-1 および AsPC 1 膵臓癌細胞の培養中に徐々 に減少します。削減するのではなく、乳酸を追加することによって乳酸性アシドーシスを模倣文化方法を確立した解糖系が乳酸7,8,9では、陽子だけでなく排泄を加速するため、重炭酸塩の濃度。さらに、中で HCl による酸性 pHe は酸性 pH 培養培地への細胞は重炭酸塩の集中力の低下の原因ではない可能性を除外することが出来ます。また、6.4 〜 7.4 異なる重炭酸塩濃度の pH で様々 なメディアを使用して、我々 は、細胞応答 pHe 影響の程度を評価できます。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium&amp;ldquo;Nissui&amp;rdquo; 2</td><td>Nissui</td><td>05919</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>10438</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)</td><td>Nacalai</td><td>09367-34</td><td></td></tr><tr><td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red</td><td>Nacalai</td><td>32778-05</td><td></td></tr><tr><td>0.5%-Trypan Blue Stain Solution</td><td>Nacalai</td><td>29853-34</td><td></td></tr><tr><td>Lactic acid solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252476</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td><td>Thermo Fisher</td><td>18091</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368702&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell lines&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>AsPC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr><tr><td>KMS-6</td><td>JCRB Cell Bank</td><td>JCRB0432</td><td></td></tr><tr><td>TIG</td><td>JCRB Cell Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC9</td><td>ATCC</td><td>CCL-212</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of an extracellular acidic ph culture system

腫瘍微小環境、低酸素や栄養飢餓などの条件は、癌の進行や悪性腫瘍で重要な役割を果たします。ただし、腫瘍の積極性とそのメカニズムの解明に酸性細胞外 pH の役割は検討されていない広く低酸素や栄養飢餓状態と比較しています。さらに、酸性細胞外腫瘍微小環境を模倣するように明確に定義された培養法は完全に報告されていません。
重炭酸塩や増加の乳酸培養液中で HCl 濃度酸性細胞外 pH による削減を維持するために単純な体外培養法をご紹介します。培地の pH は少なくとも 24 時間持続され、72 h PANC-1 および AsPC 1 膵臓癌細胞の文化を次によって徐々 に減少します。本研究では 3 つの異なる酸性メディア条件高い pH 応答性遺伝子MSMO1 INSIG1、 IDI1などと比較して低酸素や栄養飢餓.これらの遺伝子の発現は、酸性 pH のマーカーとして使用できます。これらの簡単なテクニックは、酸性腫瘍微小環境下で腫瘍の悪性度の基になるメカニズムを解明するために有益です。したがって、細胞の酸性 pH 文化体制によりがん細胞のみならず、その他酸性障害など糖尿病性ケトアシドーシスに関連して、腎の尿細管細胞など、細胞の細胞の酸性 pH 応答の発見乳酸アシドーシス、腎の尿細管性アシドーシス、呼吸性アシドーシス。

適切な重炭酸濃度を決定するには、0 - 8 mM NaHCO3 (培養液に最終濃度) の範囲で DMEM を作製し、pH 6.4 7.4 (図 1) に至ると培地を準備することに成功しました。固形腫瘍4,5pH 6.8 を細胞外 pH に達することを示す以前のレポートによると 8 mm NaHCO3 (pH 7.4) 制御媒体と 2 mM NaHCO3 (Ph6.8) 媒体と...

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Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

酸性腫瘍微小環境は、腫瘍の進行に重要な役割を果たしています。がん細胞のin vitro での酸性細胞外 pH の効果を評価するためには、単純な酸性文化体制を確立しました。

酸性細胞外 pH 培養系の確立

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

establishment-of-an-extracellular-acidic-ph-culture-system

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Fluid, Electrolyte, and Acid-Base Balance

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14.6K ビュー.  Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. 酸性腫瘍微小環境は、腫瘍の進行に重要な役割を果たしています。がん細胞のin vitro での酸性細胞外 pH の効果を評価するためには、単純な酸性文化体制を確立しました。

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Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

培養腸宿主微生物インターフェイスで合成細菌コンソーシアムの実行可能性を評価します。

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

生化学

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) hydration, mucus viscosity and activity of antimicrobial peptides, key parameters involved in innate defense of the lungs. This is of primary relevance in the field of chronic respiratory diseases such as cystic fibrosis (CF) where these parameters are dysregulated. While different groups have studied ASL pH both in vivo and in vitro, their methods report a relatively wide range of ASL pH values and even contradictory findings regarding any pH differences between non-CF and CF cells. Furthermore, their protocols do not always provide enough details in order to ensure reproducibility, most are low throughput and require expensive equipment or specialized knowledge to implement, making them difficult to establish in most labs. Here we describe a semi-automated fluorescent plate reader assay that enables the real-time measurement of ASL pH under thin film conditions that more closely resemble the in vivo situation. This technique allows for stable measurements for many hours from multiple airway cultures simultaneously and, importantly, dynamic changes in ASL pH in response to agonists and inhibitors can be monitored. To achieve this, the ASL of fully differentiated primary human airway epithelial cells (hAECs) are stained overnight with a pH-sensitive dye in order to allow for the reabsorption of the excess fluid to ensure thin film conditions. After fluorescence is monitored in the presence or absence of agonists, pH calibration is performed in situ to correct for volume and dye concentration. The method described provides the required controls to make stable and reproducible ASL pH measurements, which ultimately could be used as a drug discovery platform for personalized medicine, as well as adapted to other epithelial tissues and experimental conditions, such as inflammatory and/or host-pathogen models.

We present a protocol to make dynamic measurements of the airway surface liquid pH under thin film conditions using a plate-reader.

初代ヒト気道上皮細胞の気道表面液 pH をリアルタイムで半自動で蛍光測定

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

In vitro Monitoring of Extracellular pH in Real-Time

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to chronic inflammation. Without efficient PMN clearance at sites of infiltration, PMN can accumulate and contribute to chronic inflammatory conditions, including the intestinal diseases ulcerative colitis (UC) and Crohn's Disease (CD). The pH in the distal colon in individuals with active UC can range between a pH of 5 and 6, whereas healthy individuals maintain colonic pH in the range of 6.8-7.4. Extracellular pH has been shown to influence both intestinal epithelial cells and the infiltrating immune cells. More specifically, extracellular acidosis significantly impacts PMN. At pH below 6.5, there are increases in the production of H2O2, inhibition of apoptosis, and increases in the functional lifespan of PMN. Given the significant presence of PMN and extracellular acidification at sites of inflammation, we developed a novel model that allows for the monitoring of extracellular pH during PMN transepithelial migration in real time. Here, we describe this model and how it can be utilized to measure both the apical and basal pH during PMN trafficking. This model can be utilized to monitor extracellular pH under a wide range of conditions; including, hypoxia, PMN transepithelial migration, and for extended periods of time.

In vitro Monitoring of Extracellular pH in Real-Time

This article represents a useful in vitro assay to measure changes in extracellular pH during neutrophil (PMN) transepithelial migration (TEM)

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to ...

<meta charset="utf8"></head><body>DHNAを用いた Lactiplantibacillus plantarum におけるEETのクロノアンペロメトリー解析

Characterizing Mediated Extracellular Electron Transfer in Lactic Acid Bacteria with a Three-Electrode, Two-Chamber Bioelectrochemical System

Many bacteria perform extracellular electron transfer (EET), whereby electrons are transferred from the cell to an extracellular terminal electron acceptor. This electron acceptor can be an electrode and electrons can be delivered indirectly via a redox-active mediator molecule. Here, we present a protocol to study mediated EET in Lactiplantibacillus plantarum, a probiotic lactic acid bacterium widely used in the food industry, using a bioelectrochemical system. We detail how to assemble a three-electrode, two-chambered bioelectrochemical system and provide guidance on characterizing EET in the presence of a soluble mediator using chronoamperometry and cyclic voltammetry techniques. We use representative data from 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA)-mediated EET experiments with L. plantarum to demonstrate data analysis and interpretation. The techniques described in this protocol can open new opportunities for electro-fermentation and bioelectrocatalysis. Recent applications of this electrochemical technique with L. plantarum demonstrated an acceleration of metabolic flux towards producing fermentation end-products, which are critical flavor components in food fermentation. As such, this system has the potential to be further developed to alter flavors in food production or produce valuable chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>乳酸菌における媒介細胞外電子移動の特性評価 3電極2チャンバー生体電気化学システムによる

Here we present a protocol for characterizing mediated extracellular electron transfer (EET) in lactic acid bacteria using a three-electrode, two-chamber bioelectrochemical system. We illustrate this method with Lactiplantibacillus plantarum and the redox mediator 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid and provide a thorough description of the electrochemical techniques used to evaluate mediated EET.

乳酸菌における媒介細胞外電子移動の特性評価 3電極2チャンバー生体電気化学システムによる

Many bacteria perform extracellular electron transfer (EET), whereby electrons are transferred from the cell to an extracellular terminal electron ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its complex nature, and its diverse association with mammalian components. The goal of this protocol is to culture the gut microbiota in vitro, which allows for the study of the gut microbiota dynamics, without having to consider the contribution of the mammalian milieu. Using in vitro culturing technology, the physiological conditions of the gastro intestinal tract are simulated, including parameters such as pH, temperature, anaerobiosis, and transit time. The intestinal surface of the colon is simulated by adding mucin-coated carriers, creating a mucosal phase, and adding further dimension. The gut microbiota is introduced by inoculating with the human fecal material. Upon inoculation with this complex mixture of bacteria, specific microbes are enriched in the different longitudinal (ascending, transverse and descending colons) and transversal (luminal and mucosal) environments of the in vitro model. It is crucial to allow the system to reach a steady state, in which the community and the metabolites produced remain stable. The experimental results in this manuscript demonstrate how the inoculated gut microbiota community develops into a stable community over time. Once steady state is achieved, the system can be used to analyze bacterial interactions and community functions or to test the effects of any additives on the gut microbiota, such as food, food components, or pharmaceuticals.

Here, we present a protocol for culturing the gut microbiota of the colon in vitro, using a series of bioreactors that simulate the physiological conditions of the gastro intestinal tract.

体外養殖人間の腸内細菌を研究する技術を適用する高度な

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

生物工学

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled environment. Despite vast differences in the physiology between mammals and fish, primary cell culture protocols from fish are often based on mammalian culture conditions, often with only minor modifications. The environmental differences affect not only body temperature, but also blood serum parameters such as osmolality, pH, and pH buffer capacity. As cell culture media and similar working solutions are meant to mimic characteristics of the extracellular fluid and/or blood serum to which a cell is adapted, it is crucial that these parameters are adjusted specifically to the animal in question.
The current protocol describes optimized primary culture conditions for medaka (Oryzias latipes). The protocol provides detailed steps on how to isolate and maintain healthy dissociated pituitary cells for more than one week and includes the following steps: 1. the adjustment of the osmolality to the values found in medaka blood plasma, 2. the adjustment of the incubation temperature to normal medaka temperature (here in the aquarium facility), and 3. the adjustment of the pH and bicarbonate buffer to values comparable to other fish species living at similar temperatures. The results presented using the described protocol promote physiologically meaningful results for medaka and can be used as a reference guide by scientists making primary cell cultures from other non-mammalian species.

Here we describe a protocol to prepare and maintain primary pituitary cell cultures from medaka (Oryzias latipes). The optimized conditions in this protocol take important parameters such as temperature, osmolality, and pH into consideration by mimicking the physiological conditions of the fish, thereby enabling physiologically more meaningful results.

魚脳下垂体から質の高いプライマリ細胞培養の準備

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

神経科学

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in overall pH homeostasis. We describe protocols for ratiometric measurement of pH in vivo using pH-sensitive fluorophores localized to the vacuole or cytosol. Vacuolar pH is measured using BCECF, which localizes to the vacuole in yeast when introduced into cells in its acetoxymethyl ester form. Cytosolic pH is measured with a pH-sensitive GFP expressed under control of a yeast promoter, yeast pHluorin. Methods for measurement of fluorescence ratios in yeast cell suspensions in a fluorimeter are described. Through these protocols, single time point measurements of pH under different conditions or in different yeast mutants have been compared and changes in pH over time have been monitored. These methods have also been adapted to a fluorescence plate reader format for high-throughput experiments. Advantages of ratiometric pH measurements over other approaches currently in use, potential experimental problems and solutions, and prospects for future use of these techniques are also described.

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH can be measured in live yeast (S. cerevisiae) cells using ratiometric fluorescent dyes localized to specific cellular compartments. We describe procedures for measuring vacuolar pH with BCECF-AM, which localizes to the vacuole in yeast, and cytosolic pH with a cytosolic ratiometric pH-sensitive GFP (yeast pHluorin).

液胞と細胞質のpHの測定<emインビボで&gt;</em&gt;酵母細胞懸濁液に

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

生物学

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

共焦点顕微鏡を用いた生細胞におけるエンドサイトーシスおよび細胞質区画における同時pH測定

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

酸性細胞外 pH 培養系の確立

要約

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培養腸宿主微生物インターフェイスで合成細菌コンソーシアムの実行可能性を評価します。

初代ヒト気道上皮細胞の気道表面液 pH をリアルタイムで半自動で蛍光測定

In vitro Monitoring of Extracellular pH in Real-Time

乳酸菌における媒介細胞外電子移動の特性評価 3電極2チャンバー生体電気化学システムによる

乳酸菌における媒介細胞外電子移動の特性評価 3電極2チャンバー生体電気化学システムによる

乳酸菌における媒介細胞外電子移動の特性評価 3電極2チャンバー生体電気化学システムによる

体外養殖人間の腸内細菌を研究する技術を適用する高度な

魚脳下垂体から質の高いプライマリ細胞培養の準備

液胞と細胞質のpHの測定

共焦点顕微鏡を用いた生細胞におけるエンドサイトーシスおよび細胞質区画における同時pH測定