東京大学先端研、医学システム生物学、ゲノム科学部門と研究室のメンバーに感謝します我々 は特に感謝博士 h. 油谷、小玉徹博士、(LSBM、東大先端研、東京大学)、A 博士、博士・吉田先生・ k ・富塚 有用な議論とサポートの國里 (協和発酵キリン株式会社)。この作品は一部文部の若い科学者 (A) (26710005、ティー ・ オーエンタテインメント)、革新的な領域 (H 01567、ティー ・ オーエンタテインメントの 26116711 と 16) 科学研究費補助金・挑戦 文部科学省がん研究事業がん研究 (ティー ・ オーエンタテインメント)、小林財団、武田科学振興財団 (ティー ・ オーエンタテインメント) 日本の技術からの探索的研究 (16 K 14605、ティー ・ オーエンタテインメント) と(P 作成) 治療の進化とアメッド (ティー ・ オーエンタテインメント) 総合医療研究機構から革新的ながん対策の実践的研究。

1. 酸性の培地の準備
<ol><li>
コントロール (pH 7.4) の作製と低 pH (ペーハー 6.8) 培
	<ol>
<li>500 mL の水に L-グルタミンなし DMEM 粉末 4.75 g を溶解します。</li>
		<li>耐圧ボトルで 0.33 M NaHCO3ソリューションを準備します。 注意: NaHCO3 CO2ガスを加熱すると熱分解を発するので圧力のタイトなボトルを使用することが重要です。</li>
		<li>オートクレーブ媒体およびソリューション。25 ° C に冷却するこれらのバッファーを許可します。</li>
		<li>200 mM L-グルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシンの 5 mL の 5 mL を加えると炭酸なし DMEM の 500 mL に牛胎児血清の 50 mL。</li>
		<li>コントロール (pH 7.4) 中 2.4 mL 炭酸なし DMEM の 100 mL あたり 0.33 M NaHCO3ソリューションを追加します。低 pH (ペーハー 6.8) 中炭酸なし DMEM の 100 mL あたり 0.33 M NaHCO3溶液 0.6 mL を追加します。</li>
		<li>37 ° C で 24 時間後 5% 以下の培地の pH をチェック CO2。 注: NaHCO3溶液の量は、インキュベーターと空気圧の CO2の含有量によって異なることが培地の pH に応じて調整する必要があります。理想的には、初めて、DMEM に追加する NaHCO3ソリューションの適切な量を決定する重炭酸塩濃度と培地の pH を測定することをお勧めします。<ol>
<li>CO2インキュベーターから培養皿を削除した直後に培養液を収集し、pH 計を用いて pH を測定します。必要に応じて水浴を使用して 37 ° C で中の温度を保ちます。測定培地の pH 3 回独立。 注: NaHCO3ソリューションは 4 ° C で保存する必要があります、各メディアが新たに作成される必要があります。本研究で使用できる市販の製品は、材料のテーブルに表示されます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
乳酸誘導または HCl による酸性培養培地の準備
	<ol>
<li>(1.1.5 の手順で準備) 制御媒体の 100 mL に乳酸溶液の 74 μ L または 1 M HCl の 125 μ L を追加します。</li>
		<li>37 ° C で 24 時間後 5% 以下の培地の pH をチェック CO2。 注: 乳酸または塩酸溶液の量はまたインキュベーターと空気圧で CO2コンテンツによって異なることが培地の pH に応じて調整する必要があります。理想的には、シリアルの乳酸や媒体の目的の pH に調整するための適切な量を決定する塩酸濃度と培地の pH を測定することをお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 収穫とセルを扱う
<ol><li>37 ° C 未満 5% CO2を実行する前に、少なくとも 1 週間の実験で細胞の育成を開始します。 注: この研究で使用される細胞は、材料表に表示されます。</li>
	<li>70-90% の confluency に到達するときにセルを通過。コンフルエントになるため細胞を認めない。毎日培養中に 2-3 日毎に媒体を変更します。</li>
	<li>5 mL の PBS を追加することによって、細胞を洗います。PBS を吸引し、1 mL のトリプシンなど脱着酵素を追加します。</li>
	<li>セル丸められますをデタッチする開始になるまでは、37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>剥離細胞に培養液 5 mL を追加し、酵素を非アクティブ化します。15 mL チューブ 300 x g 吸引上清に 3 分間遠心し、細胞懸濁液を転送、再培養培地で細胞を中断します。</li>
	<li>検定とトリパン ブルーを使用して実行可能なセルを数えます。</li>
	<li>種 5.0 × 105セル/10 mL の培地に 10 センチメートルの皿の井戸。37 ° C 未満 5% で 24 時間細胞をインキュベート CO2。</li>
	<li>培養培地を吸引、5 ml の PBS、細胞を洗浄し、セクション 1 で作製した酸性培地の 10 mL を加えます。37 ° C 未満 5% で 24 時間細胞をインキュベート CO2。</li>
</ol>3. RNA の隔離
<ol><li>培地を吸引し、5 ml の PBS セルを洗ってください。RNA 抽出試薬を追加してセルを破壊 (教材の一覧表を参照してください)。</li>
	<li>料理を簡単にこすり、ピペットと RNA 抽出試薬を削除し、RNA 抽出試薬/細胞ライセートを 1.5 mL チューブを入金します。5 分間室温に置いたまま。</li>
	<li>250 μ L のクロロホルムを加え、5 分間室温で約 15 米残すと ≥8、5 分 000 × g で遠心管を積極的に振る。</li>
	<li>ピペットを使用して水相を慎重に取り外します。水様段階のいくつかの後ろに残します。別 1.5 mL チューブに配置します。</li>
	<li>水相に 550 μ L のイソプロパノールを加え、軽く混ぜます。室温で 5 分間遠心分離機 (≥20, 000 x g) 最大速度、4 ° C で 20 分を残してください。</li>
	<li>イソプロパノールを注ぐし、1 mL 75% エタノール DEPC 処理水を追加します。優しく混ぜます。5 分間 8,000 × g で遠心分離機します。</li>
	<li>ペレットが空気乾燥させエタノールをピペットします。</li>
	<li>RNA ペレットを約 15-25 μ (収量) に応じて DEPC 処理水を追加します。ミックス徹底的。</li>
	<li>260 で外径を測定することによって隔離された RNA 濃度を測定分光光度計を用いた nm。</li>
</ol>4. cDNA 合成
<ol><li>PCR の反作用の管の次のコンポーネントを組み合わせて: 最大 5 μ g 総 RNA オリゴ dT 1 μ L (50 μ M) やランダム プライマー ミックス (60 μ M)、1 μ L 10 mM dNTP、ヌクレアーゼ フリー水 14 μ L の容量を。</li>
	<li>ミックスし、簡単に小さなベンチトップ遠心分離機を使用してコンポーネントを遠心分離機 (~ 5 s)。65 ° C で 5 分間サンプル RNA のプライマーを変化させなさい。簡単にスピン (~ 5 s) 遠心し、少なくとも 1 分間氷の上速やかにサンプルを置く小さな卓上型を使用します。</li>
	<li>次のコンポーネントを追加: 4 μ L 5 x を逆転写バッファー、1 μ L 逆転写酵素 (200 U/μ L)、1 μ L RNase 阻害剤 (40 U/μ L)。 注: 市販キットの例は材料表のとおり
</li>
	<li>チューブをキャップ ミックス、および卓上型小型遠心分離機を使用してコンテンツを簡単に遠心分離機 (~ 5 s)。10 分間で 50-55 ° C 複合反応混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>10 分の 80 ° c の孵化によって反応を不活性化します。</li>
</ol>5. リアルタイム PCR を用いた酸応答性遺伝子発現の測定
<ol><li>384 ウェル反応板の次のコンポーネントを組み合わせて: 1 μ L テンプレート cDNA、0.75 μ 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine、前方に 0.3 μ L 50 μ Mプライマー、0.3 μ L 50 μ M 逆プライマー、1 μ L の Taq のポリメラーゼ、Taq ポリメラーゼ バッファーの μ L の 20 mM dNTP、16.65 μ L 水の 2.5 x 2.5 μ L 10。 注:テーブルの材料に市販のキットの例を示します。プライマーの一覧を表 1に示します。96 ウェル リアクション プレートをこのステップで使用もできます。(例えば、Taqman プローブ) 他のプローブも使用できます。</li>
	<li>実験およびリアルタイム PCR システムに次の PCR プログラムを設定: 2 分、1 サイクルは 50 ° C95 ° C、10 分、1 サイクル95 ° C 15 s の 60 ° C 1 分、40 サイクル95 ° C、15 s、1 サイクル60 ° C で 15 秒、1 サイクル95 ° C、15 s、1 サイクル。</li>
	<li>QPCR 測定器でプレートを配置します。プログラムを起動します。 注: IDI1 INSIG1、pH 応答性遺伝子MSMO1の発現タンパク質レベルで測定できます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+metabolism:+Warburg+and+beyond.">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li><li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue:+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer.">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li><li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis?.">Why do cancers have high aerobic glycolysis?.</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li><li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH.">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li><li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane.">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752 (2015).</li><li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation.">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers.">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).</li><li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression.">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li></ol>

著者綾乃近藤は協和発酵キリン株式会社の従業員

ここでは、簡単な酸性 pH 文化システムとその評価プロセスについて説明しました。中程度の酸性化、すなわち、減らされた重炭酸濃度、乳酸添加と HCl 添加の 3 つの方法の組み合わせでは、pH 応答メカニズムを徹底的に調査し、他の腫瘍に対する細胞の反応を比較できました。低酸素や栄養飢餓などアイソレータケージ条件。
このメソッドのキーは、培養液中の?...

腫瘍微小環境は、腫瘍の進行と癌細胞代謝1,2,3で重要な役割を果たしています。がん細胞が低酸素血症、栄養不足、酸性細胞外 pH (pHe) など条件にさらされること。ただし、腫瘍の進行の pHe の役割は明らかにされていないとして広く低酸素や栄養飢餓のように。腫瘍組織内 pHe を酸性、およそ pH 6.84,5に到達になることができます。酸性の pH はプロトン (H+) の好気性と嫌気性解糖系の排泄から発生し、増殖癌による乳酸細胞5,6.
最近の研究で明らかに酸性 pHe 誘起ヒストン脱アセチル化、脂肪酸酸化、酸性リソソーム酸性厳しい7,8,9,10への適応のための放出。しかし、どの細胞の酸性化を通じたメカニズム、がん行動と酸性 pH 腫瘍微小環境における規制当局が完全に決定されていないキーの id。さらに、いくつかのレポートの重炭酸塩、トリス、パイプ、および HEPES バッファーまたは乳酸と HCl、不明瞭な濃度を使用して様々 な酸性 pH メディアが中も包括的な調整後の安定性を示す報告は少ないいくつかの異なる酸性培地7,8,9,10の比較
主調整装置と細胞の酸性化のコンテキストでがん細胞の代謝変化を解明するには、酸性 pHe を維持するために単純な体外培養モデルを設立しを癌細胞11pHe の役割を検討しました。37 ° C 未満 5%、6.8 の pHe と酸性培を維持してこのメソッドを使用すると、CO2培養液の減少の重炭酸濃度を使用しています。pH 7.4 は、通常どおりに使用され、媒体を制御します。培地の pH は、少なくとも 24 時間持続され、72 h PANC-1 および AsPC 1 膵臓癌細胞の培養中に徐々 に減少します。削減するのではなく、乳酸を追加することによって乳酸性アシドーシスを模倣文化方法を確立した解糖系が乳酸7,8,9では、陽子だけでなく排泄を加速するため、重炭酸塩の濃度。さらに、中で HCl による酸性 pHe は酸性 pH 培養培地への細胞は重炭酸塩の集中力の低下の原因ではない可能性を除外することが出来ます。また、6.4 〜 7.4 異なる重炭酸塩濃度の pH で様々 なメディアを使用して、我々 は、細胞応答 pHe 影響の程度を評価できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#8220;Nissui&#8221; 2</td>
			<td>Nissui</td>
			<td>05919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>32778-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5%-Trypan Blue Stain Solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>18091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4368702&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsPC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMS-6</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td>JCRB0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIG</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an extracellular acidic ph culture system

腫瘍微小環境、低酸素や栄養飢餓などの条件は、癌の進行や悪性腫瘍で重要な役割を果たします。ただし、腫瘍の積極性とそのメカニズムの解明に酸性細胞外 pH の役割は検討されていない広く低酸素や栄養飢餓状態と比較しています。さらに、酸性細胞外腫瘍微小環境を模倣するように明確に定義された培養法は完全に報告されていません。
重炭酸塩や増加の乳酸培養液中で HCl 濃度酸性細胞外 pH による削減を維持するために単純な体外培養法をご紹介します。培地の pH は少なくとも 24 時間持続され、72 h PANC-1 および AsPC 1 膵臓癌細胞の文化を次によって徐々 に減少します。本研究では 3 つの異なる酸性メディア条件高い pH 応答性遺伝子MSMO1 INSIG1、 IDI1などと比較して低酸素や栄養飢餓.これらの遺伝子の発現は、酸性 pH のマーカーとして使用できます。これらの簡単なテクニックは、酸性腫瘍微小環境下で腫瘍の悪性度の基になるメカニズムを解明するために有益です。したがって、細胞の酸性 pH 文化体制によりがん細胞のみならず、その他酸性障害など糖尿病性ケトアシドーシスに関連して、腎の尿細管細胞など、細胞の細胞の酸性 pH 応答の発見乳酸アシドーシス、腎の尿細管性アシドーシス、呼吸性アシドーシス。

適切な重炭酸濃度を決定するには、0 - 8 mM NaHCO3 (培養液に最終濃度) の範囲で DMEM を作製し、pH 6.4 7.4 (図 1) に至ると培地を準備することに成功しました。固形腫瘍4,5pH 6.8 を細胞外 pH に達することを示す以前のレポートによると 8 mm NaHCO3 (pH 7.4) 制御媒体と 2 mM NaHCO3 (Ph6.8) 媒体と...

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Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

酸性腫瘍微小環境は、腫瘍の進行に重要な役割を果たしています。がん細胞のin vitro での酸性細胞外 pH の効果を評価するためには、単純な酸性文化体制を確立しました。

酸性細胞外 pH 培養系の確立

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

establishment-of-an-extracellular-acidic-ph-culture-system

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14.5K ビュー.  Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. 酸性腫瘍微小環境は、腫瘍の進行に重要な役割を果たしています。がん細胞のin vitro での酸性細胞外 pH の効果を評価するためには、単純な酸性文化体制を確立しました。