フミン酸の定量のための新しい標準法は、既存の調節的に受け入れられている方法と比較して、より正確で正確な分析を提供し、また、純粋な疎水性フルボ酸定量のための標準的な方法を提供する。このプロトコルの利点は、フミン酸および疎水性フルボ酸濃度の重量分析を灰フリーベースで提供し、抽出プロセスが最適化され、サンプルからフミン酸とフルボ酸の両方の最高の回収率が得られることです。手順を実証するのは、私たちの腐植化学研究所の分析化学者であるRyan Fountainです。
固体サンプルを調製するには、乳鉢と乳棒を使用して、よく混合されたサンプルの100%が米国標準ふるい、メッシュサイズ番号200を通過することができるまで、分析されるサンプルの約5グラムを粉砕する。粉末の含水率を重量測定的に測定するには、サンプル粉末の約2グラムを予め加重されたアルミニウム計量ボートに移し、ボートとサンプルの質量を記録する。次に、計量ボートを摂氏102度の乾燥炉に24時間置きます。
翌日、ボートをデシケーターに入れて少なくとも1時間冷却してから、計量ボートと乾燥サンプルの質量を計量して記録し、式を使用して指示に従って含水率を決定します。固体サンプルから抽出を実行するには、残りのサンプルの約2.5グラムの重量を量り、その重量を小数点以下4桁まで記録します。その後、サンプルを1リットルの三角フラスコに積み込み、重量ボートを脱イオン水ですすぎ、すべての鉱石を除去します。
ビーカーを1リットルに0.1モルの水酸化ナトリウムで満たし、5〜7センチメートルの磁気攪拌子を加えて、攪拌プレート上で毎分300〜400回転でサンプルの迅速な攪拌を容易にする。試料が十分に混合されたら、フラスコのヘッドスペースを窒素ガスで排気し、フラスコ開口部を気密カバーで密閉し、フラスコを攪拌板上に置き、毎分300~400回転で16~18時間混合する。液体材料抽出の場合は、容器の底に落ちた可能性のある残留物を含む試験液体が均一に混合されていることを確認するために、サンプルを徹底的に振ってください。
試験液の約5グラムの重量を量り、その重量を小数点以下4桁まで記録する。次いで、液体を1リットルのメスシリンダーに加え、シリンダーに0.1モルの水酸化ナトリウムを充填して最終容量1リットルにする。磁気攪拌子を使用して、試験サンプルが完全に混合されるまでサンプルを迅速に混合してから、混合物を1リットルの三角フラスコに移し、その後、窒素ガスでヘッドスペースを排気し、フラスコの内容物を毎分300〜400回転で1時間攪拌する。
アルカリ抽出物から非可溶性物質を除去するために、撹拌インキュベーションの終わりに、混合物を適切な遠沈管に移し、試料の全体積を4、921x Gで室温で30分間遠心分離する。遠心分離の最後に、疎水性フルボ酸を含むフミン酸およびフルボ画分を含むアルカリ性上清を、磁気攪拌子付きの清潔な1リットルの三角フラスコに集める。フルボ画分からのフミン酸沈殿の場合、回収したアルカリ抽出物を攪拌板上で毎分300~400回転で攪拌しながら、溶液の中央部にpHプローブを挿入し、濃塩酸を加えてpH1.0プラスマイナス0.1の安定pHに達するまで滴下する。
pHが安定したら、プローブと攪拌子を外し、イオン交換水ですすぎ、フラスコを気密カバーで密閉します。沈殿したフミン酸が底に沈むまでフラスコを1〜6時間放置してから、抽出物を遠心分離し、フミン酸を4,921x Gで1時間沈殿させた。遠心分離の最後に、フルボ画分含有上清を清潔な1リットルの三角フラスコに注ぎ、フラスコを気密カバーで密封する。
フミン酸含有遠心管を摂氏100度の乾燥オーブンに24時間置き、乾燥を確実にするために蓋が緩んでいるか、または取り外していることを確認してください。乾燥後、チューブを室温に達するまでデシケーターで冷却します。冷却後、ヘラを使用して各チューブからの残渣を単一のタール秤量ボートに移し、抽出されたフミン酸サンプルの質量を決定する。
サンプル内の灰分含有量を決定するには、約30ミリグラムの乾燥フミン酸を清潔で予め計量されたセラミック皿に移し、計量サンプルおよび皿の質量を決定する。次に、フミン酸をマッフルオーブンで摂氏600度で2時間燃焼させてから、皿をデシケーターで冷却する。冷めたら、皿の重さを量り、式を使用して灰分率を計算します。
純粋なフミン酸の最終質量を決定するには、式を使用して灰分を補正します。次に、式を使用して純粋なフミン酸濃度を決定します。新しい低圧ポリメチルメタクリレート DAX8 樹脂充填クロマトグラフィーカラムを作製し、ビーカーで樹脂をメタノールに 2 時間浸してから、メタノールがすべて除去されるまで脱イオン水で樹脂を十分にすすいでください。
次に、水に浮かんでいる小さな樹脂粒子を取り除きます。完全にすすぎすぎたら、すすぎまたは再生した樹脂を、樹脂ベッドサポート用の10ミクロンのフリットを備えたエンドピースを取り付けた5 x 25センチメートルのガラスクロマトグラフィーカラムに注ぎ、カラムの上部に2.5〜5センチメートルを残し、トップピースをカラムに交換します。以前に使用した樹脂を再生したり、新しく洗浄したての新しい樹脂を調製したりするには、ペリスタルティックポンプを使用して、流出液のpHが流入剤のpHに等しくなるまで、35〜40ミリリットルの流量で0.1モル塩酸をカラムの底部にポンプで送り込み、次いで、流出物のpHが流入剤のpHに等しくなるまで脱イオン水をカラムの上部にポンプで送り込みます。
樹脂ベッドが充填されたら、ペリスタルティックポンプを使用して、35 ~ 40 ミリリットルの流量でカラムの上部から低圧でフルボフラクションをカラムにロードします。フルボ画分が樹脂に完全に装填されたら、脱イオン水で樹脂を洗浄し、非吸着の親水性フルボ画分を除去する。350ナノメートルでのカラム廃液の吸光度がカラムの洗浄に使用された脱イオン水の吸光度と等しくなるまで、カラムを脱イオン水で洗浄します。
HFAを脱離させるには、カラムの底部から0.1モルの水酸化ナトリウムをポンプで送り込み、ポンプでフルベートナトリウム廃液を清潔で十分な大きさの容器に捕捉します。カラム流出液の吸光度が350ナノメートルにおける0.1モル水酸化ナトリウム流入の吸光度に等しいとき、HFAの全てが脱離した。プロトン化によりHFAを脱灰させるには、まず大きなビーカーにプロトン/陽イオン交換樹脂を注ぎ、樹脂を覆い、新鮮な脱イオン水で数回混合し、すすぎのたびに水を注ぎ、赤色が完全に除去されるまで水を送ります。
最後の洗浄後、樹脂を1モル塩酸で覆い、混合物を少なくとも2時間放置し、30分ごとに攪拌する。酸性化処理が終わったら、酸をイオン交換水に交換し、攪拌棒で15秒間激しく攪拌した後、フラスコの底に樹脂を落として水を注ぎ落とします。すすぎ水の電気伝導率が0.7マイクロシーメンス/センチメートル以下になるまでこのプロセスを繰り返し、再生樹脂を樹脂を保持するためのガラスフリットで5×50センチメートルのカラムにロードします。
次に、樹脂を新鮮な脱イオン水で覆い、廃液の電気伝導率が1センチメートルあたり120マイクロシーメンス未満になるまで、重力供給によって強陽イオン/プロトン交換樹脂を通してフルベートナトリウムを繰り返し通過させる。すべてのFAが樹脂から除去されることを確実にするために、最終通過後、350ナノメートルでの流出物の吸光度がカラムの洗浄に使用された脱イオン水と同じになるまで、脱イオン水で樹脂を洗浄する。洗浄液および吸光度をチェックするために使用した任意の廃液を精製FA溶液に加える。
FAの除去を助けるために、樹脂を数回攪拌することができる。摂氏55度のロータリーエバポレーターを使用してFAを約15プラスマイナス2ミリリットルの体積に濃縮し、FA濃縮物の全容量を50ミリリットルのプラスチック遠沈管に完全に移します。乾燥オーブンで一定の乾燥までサンプルを摂氏60度またはマイナス3度に乾燥させ、チューブをデシケーターに移して冷却します。
サンプルが冷却されたら、ヘラを使用して抽出されたFAを事前に計量された計量紙にこすりつけ、フミン酸について実証されているように、元のサンプル中の灰分比、抽出FA重量、および純度FAパーセントを決定します。この表には、HAおよびHFAの非常に異なる濃度を有する液体市販サンプルからのHAおよびHFAの抽出方法に関する精度データが示されている。HAの残留標準偏差はHFAのそれよりも低かったが、3つの液体サンプルの平均HFA残留標準偏差は6.83%であり、高い精度を示した。
ホロウィッツ比も、HFA分析の1つだけで2より大きかった。この表には、3つの腐植鉱石サンプルからHAおよびHFAを抽出するための精度データが示されている。以前の分析と同様に、鉱石2から抽出されたHFAと鉱石3から抽出されたHAを除いて、ホロウィッツ比はすべて2未満であり、腐植鉱石サンプルからのHAおよびHFAの抽出のためのこの方法の精度の高さを実証した。
この分析では、HAまたはHFAの回収に有意に影響を及ぼす植物生物刺激剤添加剤は観察されなかった。これらの表には、非常に低濃度の市販製品を刺激した液体サンプルからのHAおよびHFAの回収率が示されている。回収率は良好で、HAでは88%~97%、HFAでは92~104%の範囲であったが、実験室での複製を行う必要性も示唆していた。
この手順に続いて、得られた乾燥フミン酸およびフルボ酸は、炭素-13およびプロトンNMR電子共鳴、ならびに超高分解能質量分析などの特性評価目的、とりわけ有用な技術に使用することができる。そして、これは腐植質化学の特性評価に使用でき、植物の適応度と根底にある植物防御メカニズムとの構造活性関係を深く掘り下げるのに有用なツールにも使用できます。
