Die neue Standardmethode zur Quantifizierung von Huminsäuren bietet eine genauere und präzisere Analyse im Vergleich zu den bestehenden regulatorisch akzeptierten Methoden und bietet auch eine Standardmethode für die reine hydrophobe Fulvosäurequantifizierung. Der Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es eine gravimetrische Analyse der huminen und hydrophoben Fulvosäurekonzentrationen auf aschefreier Basis ermöglicht und der Extraktionsprozess optimiert wurde, um die höchsten Rückgewinnungen von Humin- und Fulvosäuren aus Proben zu erhalten. Das Verfahren wird Ryan Fountain, ein analytischer Chemiker aus unserem Huminchemie-Labor, demonstrieren.
Um eine feste Probe vorzubereiten, verwenden Sie einen Mörser und Stößel, um etwa fünf Gramm der zu analysierenden Probe zu zerkleinern, bis 100% der gut gemischten Probe ein US-Standardsieb mit der Maschenweite Nummer 200 passieren können. Um den Feuchtigkeitsgehalt des Pulvers gravimetrisch zu bestimmen, geben Sie etwa zwei Gramm des Probenpulvers in ein vorgewogenes Aluminium-Wiegeboot und zeichnen Sie die Masse des Bootes und der Probe auf. Als nächstes stellen Sie das Wiegeboot für 24 Stunden in einen Trockenofen bei 102 Grad Celsius.
Legen Sie das Boot am nächsten Tag in einen Exsikkator, um mindestens eine Stunde lang abzukühlen, bevor Sie die Masse des Wiegebootes und der getrockneten Probe wie möglich aufzeichnen, und verwenden Sie dann die Formel, um den Feuchtigkeitsgehalt wie angegeben zu bestimmen. Um eine Extraktion aus einer festen Probe durchzuführen, wiegen Sie etwa 2,5 Gramm der verbleibenden Probe und notieren Sie das Gewicht auf vier Dezimalstellen. Laden Sie dann die Probe in einen Ein-Liter-Erlenmeyerkolben und spülen Sie das Wiegeboot mit entionisiertem Wasser ab, um das gesamte Erz zu entfernen.
Füllen Sie das Becherglas auf einen Liter mit 0,1-molarem Natriumhydroxid und fügen Sie einen fünf bis sieben Zentimeter langen magnetischen Rührstab hinzu, um ein schnelles Rühren der Probe bei 300 bis 400 Umdrehungen pro Minute auf einer Rührplatte zu ermöglichen. Wenn die Probe gründlich gemischt wurde, evakuieren Sie den Kopfraum des Kolbens mit Stickstoffgas, verschließen Sie dann die Kolbenöffnung mit einer luftdichten Abdeckung und legen Sie den Kolben auf eine Rührplatte zum Mischen mit 300 bis 400 Umdrehungen pro Minute für 16 bis 18 Stunden. Schütteln Sie bei der Extraktion von flüssigem Material die Probe gründlich, um sicherzustellen, dass die Prüfflüssigkeit homogen gemischt ist, einschließlich etwaiger Rückstände, die möglicherweise auf den Boden des Behälters gefallen sind.
Wiegen Sie etwa fünf Gramm der Testflüssigkeit und notieren Sie das Gewicht auf vier Dezimalstellen. Dann fügen Sie die Flüssigkeit zu einem Ein-Liter-Messzylinder hinzu und füllen Sie den Zylinder mit 0,1-molarem Natriumhydroxid auf ein Endvolumen von einem Liter. Verwenden Sie einen magnetischen Rührstab, um die Probe wie demonstriert schnell zu mischen, bis die Probe vollständig gemischt ist, bevor Sie die Mischung in einen Ein-Liter-Erlenmeyerkolben überführen, dann evakuieren Sie den Kopfraum mit Stickstoffgas und rühren Sie den Kolbeninhalt bei 300 400 Umdrehungen pro Minute für eine Stunde, wie demonstriert.
Um nicht lösliche Materialien aus alkalischen Extrakten zu entfernen, wird am Ende der Rührinkubation die Mischung in geeignete Zentrifugenröhrchen überführt und das gesamte Probenvolumen bei 4,921x G für 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Am Ende der Zentrifugation wird der alkalische Überstand, der die Huminsäure und die Fulvofraktion enthält, die die hydrophobe Fulvosäure enthält, in einem sauberen Ein-Liter-Erlenmeyerkolben mit einem magnetischen Rührstab gesammelt. Für die Huminsäurefällung aus der Fulvofraktion wird unter Rühren des gesammelten alkalischen Extrakts bei 300 bis 400 Umdrehungen pro Minute auf einer Rührplatte eine pH-Sonde in den mittleren Teil der Lösung eingeführt und konzentrierte Salzsäure tropfenweise zugegeben, bis ein stabiler pH-Wert von pH 1,0 plus oder minus 0,1 erreicht ist.
Sobald der pH-Wert stabil ist, entfernen Sie die Sonde und den Rührenstab, spülen Sie sie mit entionisiertem Wasser ab und verschließen Sie den Kolben mit einer luftdichten Abdeckung. Lassen Sie den Kolben ein bis sechs Stunden ruhen, bis sich die ausgefällte Huminsäure auf dem Boden festgesetzt hat, bevor der Extrakt zentrifugiert und huminsäure bei 4,921x G für eine Stunde ausgefällt wird. Am Ende der Zentrifugation werden die fulvicfraktionshaltigen Überstände in einen sauberen Einliter-Erlenmeyerkolben gegossen und der Kolben mit einem luftdichten Deckel verschlossen.
Stellen Sie die huminsäurehaltigen Zentrifugenröhrchen für 24 Stunden in einen 100 Grad Celsius heißen Trockenschrank und stellen Sie sicher, dass die Deckel locker oder entfernt sind, um die Trocknung zu gewährleisten. Nach dem Trocknen kühlen Sie die Röhrchen in einem Exsikkator ab, bis sie Raumtemperatur erreichen. Verwenden Sie nach dem Abkühlen einen Spatel, um den Rückstand aus jedem Röhrchen in ein einzelnes teeriertes Wiegeboot zu überführen, um die Masse der extrahierten Huminsäureprobe zu bestimmen.
Um den Aschegehalt in der Probe zu bestimmen, geben Sie etwa 30 Milligramm der getrockneten Huminsäure in eine saubere, vorgewogene Keramikschale, um die Masse der Wägeprobe und der Schale zu bestimmen. Als nächstes verbrennen Sie die Huminsäure in einem Muffelofen für zwei Stunden bei 600 Grad Celsius, bevor Sie die Schüssel im Exsikkator abkühlen. Nach dem Abkühlen wiegen Sie die Schüssel und verwenden Sie die Formel, um das Ascheverhältnis zu berechnen.
Um die Endmasse der reinen Huminsäure zu bestimmen, verwenden Sie die Formel, um den Aschegehalt zu korrigieren. Verwenden Sie dann die Formeln, um die reine Huminsäurekonzentration zu bestimmen. Um eine neue Niederdruck-Polymethylmethacrylat-DAX8-Harzchromatographiesäule herzustellen, tränken Sie das Harz im Methanol für zwei Stunden in einem Becherglas, bevor Sie das Harz gründlich mit entionisiertem Wasser abspülen, bis das gesamte Methanol entfernt ist.
Entfernen Sie dann alle kleinen Harzpartikel, die auf dem Wasser schwimmen. Nach dem gründlichen Spülen gießen Sie das gespülte oder regenerierte Harz in eine 5 x 25 Zentimeter große Glaschromatographiesäule, die mit einem Endstück mit einer 10-Mikron-Fritte zur Harzbettunterstützung ausgestattet ist, wobei 2,5 bis 5 Zentimeter an der Oberseite der Säule verbleiben und das obere Stück auf der Säule ersetzt wird. Um ein zuvor verwendetes Harz aufzuarbeiten oder ein frisch gewaschenes neues Harz herzustellen, verwenden Sie die Peristaltikpumpe, um 0,1-molare Salzsäure mit einer Durchflussrate von 35 bis 40 Millilitern durch den Boden der Säule zu pumpen, bis der pH-Wert des Abwassers dem pH-Wert des Zuflusses entspricht, und pumpen Sie dann deionisiertes Wasser in die Oberseite der Säule, bis der pH-Wert des Abwassers dem pH-Wert des Zuflusses entspricht.
Sobald das Harzbett gepackt ist, verwenden Sie eine Peristaltikpumpe, um die Fulvic-Fraktion unter niedrigem Druck über die Oberseite der Säule mit einer Durchflussrate von 35 bis 40 Milliliter auf die Säule zu laden. Sobald die Fulvic-Fraktion vollständig auf das Harz geladen wurde, waschen Sie das Harz mit deionisiertem Wasser, um die nicht adsorbierte hydrophile Fulvic-Fraktion zu entfernen. Waschen Sie die Säule mit entionisiertem Wasser, bis die Absorption des Säulenabflusses bei 350 Nanometern der des entionisierten Wassers entspricht, das zum Waschen der Säule verwendet wird.
Um das HFA zu desorbieren, pumpen Sie 0,1-molares Natriumhydroxid über den Boden der Säule und fangen Sie das Pumpnatrium-Fulvat-Abwasser in einem sauberen, ausreichend großen Behälter auf. Das gesamte HFA wurde desorbiert, wenn die Absorption des Säulenabflusses gleich der Absorption von 0,1-molarem Natriumhydroxideinfluss bei 350 Nanometern ist. Um das HFA durch Protonierung zu entaschen, gießen Sie zuerst Protonen- / Kationenaustauscherharz in ein großes Becherglas und bedecken und mischen Sie das Harz mehrmals mit frischem entionisiertem Wasser, wobei das Wasser nach jeder Spülung abgegossen wird, bis die rote Farbe vollständig entfernt wurde.
Nach der letzten Wäsche das Harz mit einer molaren Salzsäure bedecken und die Mischung mindestens zwei Stunden stehen lassen, wobei alle 30 Minuten gerührt wird. Ersetzen Sie am Ende der Säuerungsbehandlung die Säure durch entionisiertes Wasser und rühren Sie 15 Sekunden lang kräftig mit einem Rührstab um, bevor Sie das Harz auf den Boden des Kolbens fallen lassen und das Wasser abgießen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die elektrische Leitfähigkeit des Spülwassers kleiner oder gleich 0,7 Mikrosiemens pro Zentimeter ist, und laden Sie das regenerierte Harz in eine 5 x 50 Zentimeter große Säule mit einer Glasfritte zur Rückhaltung des Harzes.
Bedecken Sie dann das Harz mit frischem entionisiertem Wasser und leiten Sie das Natriumgelvat wiederholt durch das starke Kation / Protonenaustauschharz durch Schwerkraftzufuhr, bis die elektrische Leitfähigkeit des Abwassers weniger als 120 Mikrosiemens pro Zentimeter beträgt. Um sicherzustellen, dass das gesamte FA aus dem Harz entfernt wird, waschen Sie das Harz nach dem letzten Durchgang mit entionisiertem Wasser, bis die Absorption des Abwassers bei 350 Nanometern der desionisierten Wassers entspricht, das zum Waschen der Säule verwendet wird. Fügen Sie die Wäsche und das zur Überprüfung der Absorption verwendete Abwasser der gereinigten FA-Lösung hinzu.
Um bei der Entfernung des FA zu helfen, kann das Harz mehrmals gerührt werden. Verwenden Sie einen Rotationsverdampfer bei 55 Grad Celsius, um das FA auf ein Volumen von etwa 15 plus oder minus zwei Millilitern zu konzentrieren und das gesamte Volumen des FA-Konzentrats vollständig in ein 50-Milliliter-Kunststoffzentrifugenrohr zu übertragen. Trocknen Sie die Probe auf 60 plus oder minus drei Grad Celsius bis zur konstanten Trockenheit im Trockenschrank und geben Sie das Röhrchen zum Abkühlen in den Exsikkator.
Wenn die Probe abgekühlt ist, verwenden Sie einen Spatel, um das extrahierte FA auf ein Stück vorgewogenes Wägepapier zu kratzen und das Ascheverhältnis, das extrahierte FA-Gewicht und den Prozentsatz des reinen FA in der Ursprünglichprobe zu bestimmen, wie für die Huminsäure demonstriert. In dieser Tabelle sind Präzisionsdaten für die Methode der Extraktion von HA und HFA aus flüssigen kommerziellen Proben mit sehr unterschiedlichen Konzentrationen von HA und HFA dargestellt. Die Reststandardabweichung für HA war niedriger als die für HFA, aber die durchschnittliche HFA-Reststandardabweichung über drei flüssige Proben betrug 6,83%, was auf ein hohes Maß an Präzision hinweist.
Das Horowitz-Verhältnis war auch größer als zwei für nur eine der HFA-Analysen. In dieser Tabelle sind Präzisionsdaten für die Extraktion von HA und HFA aus drei Huminerzproben dargestellt. Ähnlich wie bei der vorherigen Analyse lagen mit Ausnahme des HFA aus Erz zwei und des HA aus Erz drei alle Horowitz-Verhältnisse unter zwei, was den hohen Grad an Präzision dieser Methode für die Extraktion von HA und HFA aus Huminerzproben zeigt.
In dieser Analyse wurden keine pflanzlichen Biostimulanzienzusätze beobachtet, die die Rückgewinnung von HA oder HFA signifikant beeinflussen. In diesen Tabellen sind die Rückgewinnungen von HA und HFA aus flüssigen Proben dargestellt, die kommerzielle Produkte mit sehr niedrigen Konzentrationen stimuliert haben. Die Gewinnungsraten waren ausgezeichnet und lagen zwischen 88 % und 97 % für HA und 92 % und 104 % für HFA, was aber auch auf die Notwendigkeit hinweist, Laborreplikate durchzuführen.
Nach diesem Verfahren können die erhaltenen trockenen Humin- und Fulvosäuren für Charakterisierungszwecke verwendet werden, wie die Kohlenstoff-13- und die Protonen-NMR-Elektronenresonanz und die ultrahochauflösende Massenspektrometrie, unter anderem nützliche Techniken. Und dies kann für die Charakterisierung der Humuschemie verwendet werden, sowie ein nützliches Werkzeug, um tief in die Struktur-Aktivitäts-Beziehung mit pflanzenfitness und den zugrunde liegenden pflanzlichen Abwehrmechanismen einzutauchen.
