La nouvelle méthode standard de quantification des acides humiques fournit une analyse plus précise et plus précise par rapport aux méthodes existantes acceptées par le régulateur, et fournit également une méthode standard pour la quantification de l’acide fulvique hydrophobe pur. L’avantage de ce protocole est qu’il fournit une analyse gravimétrique des concentrations d’acide fulvique humique et hydrophobe sur une base sans cendres, et le processus d’extraction a été optimisé pour obtenir les récupérations les plus élevées des acides humique et fulvique à partir d’échantillons. Ryan Fountain, un chimiste analytique de notre laboratoire de chimie humique, fera la démonstration de la procédure.
Pour préparer un échantillon solide, utilisez un mortier et un pilon pour écraser environ cinq grammes de l’échantillon à analyser jusqu’à ce que 100% de l’échantillon bien mélangé puisse passer à travers un tamis standard américain, numéro de maillage 200. Pour déterminer gravimétriquement la teneur en humidité de la poudre, transférez environ deux grammes de l’échantillon de poudre dans un bateau de pesage en aluminium prépondéré et enregistrez la masse du bateau et de l’échantillon. Ensuite, placez le bateau de pesée dans un four de séchage à 102 degrés Celsius pendant 24 heures.
Le lendemain, placez le bateau dans un dessiccateur pour refroidir pendant au moins une heure avant de peser et d’enregistrer la masse du bateau de pesée et de l’échantillon séché, puis utilisez la formule pour déterminer la teneur en humidité indiquée. Pour effectuer une extraction à partir d’un échantillon solide, peser environ 2,5 grammes de l’échantillon restant et enregistrer le poids à quatre décimales. Ensuite, chargez l’échantillon dans une fiole d’Erlenmeyer d’un litre et rincez le bateau de pesée avec de l’eau désionisée pour enlever tout le minerai.
Remplissez le bécher à un litre avec de l’hydroxyde de sodium de 0,1 molaire et ajoutez une barre d’agitation magnétique de cinq à sept centimètres pour faciliter une agitation rapide de l’échantillon à 300 à 400 tours par minute sur une plaque à mélanger. Lorsque l’échantillon a été bien mélangé, évacuer l’espace de tête de la fiole avec de l’azote gazeux, puis sceller l’ouverture de la fiole avec un couvercle hermétique et placer la fiole sur une plaque d’agitation pour mélanger à 300 à 400 tours par minute pendant 16 à 18 heures. Pour l’extraction de matières liquides, bien agiter l’échantillon pour s’assurer que le liquide d’essai est mélangé de manière homogène, y compris tout résidu qui pourrait être tombé au fond du récipient.
Peser environ cinq grammes du liquide d’essai et enregistrer le poids à quatre décimales. Ensuite, ajoutez le liquide à un cylindre gradué d’un litre et remplissez le cylindre d’hydroxyde de sodium 0,1 molaire jusqu’à un volume final d’un litre. Utilisez une barre d’agitation magnétique pour mélanger rapidement l’échantillon, comme démontré jusqu’à ce que l’échantillon d’essai soit complètement mélangé avant de transférer le mélange dans une fiole d’Erlenmeyer d’un litre, puis évacuez l’espace de la tête avec de l’azote gazeux et remuez le contenu de la fiole à 300 400 tours par minute pendant une heure, comme démontré.
Pour éliminer les matières non solubles des extraits alcalins, à la fin de l’incubation sous agitation, transférer le mélange dans des tubes centrifuges appropriés et centrifuger tout le volume de l’échantillon à 4 921 x G pendant 30 minutes à température ambiante. À la fin de la centrifugation, recueillir le surnageant alcalin contenant l’acide humique et la fraction fulvique, qui contient l’acide fulvique hydrophobe, dans une fiole d’Erlenmeyer propre d’un litre avec une barre d’agitation magnétique. Pour la précipitation de l’acide humique à partir de la fraction fulvique, tout en remuant l’extrait alcalin recueilli à 300 à 400 tours par minute sur une plaque d’agitation, insérez une sonde de pH dans la partie centrale de la solution et ajoutez l’acide chlorhydrique concentré jusqu’à ce qu’un pH stable de pH 1,0 plus ou moins 0,1 soit atteint.
Une fois le pH stable, retirez la sonde et remuez la barre, rincez-les à l’eau désionisée et scellez la fiole avec un couvercle hermétique. Laissez reposer la fiole pendant une à six heures jusqu’à ce que l’acide humique précipité se soit déposé au fond avant de centrifuger l’extrait et de précipiter l’acide humique à 4 921x G pendant une heure. À la fin de la centrifugation, verser les surnageants contenant la fraction fulvique dans une fiole d’Erlenmeyer propre d’un litre et sceller la fiole avec un couvercle hermétique.
Placez les tubes de centrifugeuse contenant de l’acide humique dans un four de séchage à 100 degrés Celsius pendant 24 heures et assurez-vous que les couvercles sont desserrés ou retirés pour assurer le séchage. Après séchage, refroidir les tubes dans un dessiccateur jusqu’à ce qu’ils atteignent la température ambiante. Après refroidissement, utilisez une spatule pour transférer le résidu de chaque tube dans un seul bateau de pesée goudronné afin de déterminer la masse de l’échantillon d’acide humique extrait.
Pour déterminer la teneur en cendres dans l’échantillon, transférer environ 30 milligrammes d’acide humique séché dans un plat en céramique propre et pré-pesé pour déterminer la masse de l’échantillon et du plat de pesage. Ensuite, brûlez l’acide humique dans un four à moufle pendant deux heures à 600 degrés Celsius avant de refroidir le plat dans le dessiccateur. Une fois refroidi, pesez le plat et utilisez la formule pour calculer le rapport de cendres.
Pour déterminer la masse finale de l’acide humique pur, utilisez la formule pour corriger la teneur en cendres. Ensuite, utilisez les formules pour déterminer la concentration d’acide humique pur. Pour préparer une nouvelle colonne de chromatographie en résine de polyméthacrylate de méthyle DAX8 à basse pression, faites tremper la résine dans le méthanol pendant deux heures dans un bécher avant de rincer soigneusement la résine avec de l’eau désionisée jusqu’à ce que tout le méthanol soit retiré.
Ensuite, retirez toutes les petites particules de résine flottant sur l’eau. Une fois bien rincée, versez la résine rincée ou régénérée dans une colonne de chromatographie sur verre de 5 x 25 centimètres équipée d’un embout avec une fritte de 10 microns pour le support du lit en résine, en laissant 2,5 à 5 centimètres en haut de la colonne et remplacez la pièce supérieure sur la colonne. Pour remettre à neuf une résine déjà utilisée ou préparer une nouvelle résine fraîchement lavée, utilisez la pompe péristaltique pour pomper de l’acide chlorhydrique 0,1 molaire à un débit de 35 à 40 millilitres par le bas de la colonne jusqu’à ce que le pH de l’effluent soit égal au pH de l’influent, puis pompez l’eau désionisée dans le haut de la colonne jusqu’à ce que le pH de l’effluent soit égal au pH de l’influent.
Une fois le lit de résine emballé, utilisez une pompe péristaltique pour charger la fraction fulvique sur la colonne sous basse pression via le haut de la colonne à un débit de 35 à 40 millilitres. Une fois que la fraction fulvique a été complètement chargée sur la résine, lavez la résine avec de l’eau désionisée pour éliminer la fraction fulvique hydrophile non adsorbée. Laver la colonne avec de l’eau désionisée jusqu’à ce que l’absorbance de l’effluent de la colonne à 350 nanomètres soit égale à celle de l’eau désionisée utilisée pour laver la colonne.
Pour désorber le HFA, pomper l’hydroxyde de sodium 0,1 molaire par le fond de la colonne et capturer l’effluent de fulvate de sodium de la pompe dans un récipient propre et de taille suffisante. Tout le HFA a été désorbé lorsque l’absorbance de l’effluent de la colonne est égale à l’absorbance de l’influent d’hydroxyde de sodium 0,1 molaire à 350 nanomètres. Pour dé-cendres du HFA par protonation, versez d’abord de la résine échangeuse proton/cation dans un grand bécher et couvrez et mélangez la résine avec de l’eau fraîche désionisée plusieurs fois, en versant de l’eau après chaque rinçage jusqu’à ce que la couleur rouge ait été complètement éliminée.
Après le dernier lavage, couvrir la résine d’une molaire d’acide chlorhydrique et laisser reposer le mélange pendant au moins deux heures, en remuant toutes les 30 minutes. À la fin du traitement d’acidification, remplacez l’acide par de l’eau désionisée et remuez vigoureusement avec une tige d’agitation pendant 15 secondes avant de laisser tomber la résine au fond de la fiole et de verser l’eau. Répétez le processus jusqu’à ce que la conductivité électrique de l’eau de rinçage soit inférieure ou égale à 0,7 microSiemens par centimètre et chargez la résine régénérée dans une colonne de 5 x 50 centimètres avec une fritte en verre pour retenir la résine.
Ensuite, couvrez la résine avec de l’eau fraîche désionisée et passez à plusieurs reprises le fulvate de sodium à travers la résine forte échangée par cation / proton par gravité jusqu’à ce que la conductivité électrique de l’effluent soit inférieure à 120 microSiemens par centimètre. Pour s’assurer que tout le FA est retiré de la résine, après le passage final, lavez la résine avec de l’eau désionisée jusqu’à ce que l’absorbance de l’effluent à 350 nanomètres soit la même que l’eau désionisée utilisée pour laver la colonne. Ajouter le lavage et tout effluent utilisé pour vérifier l’absorbance à la solution d’AF purifiée.
Pour aider à l’élimination du FA, la résine peut être agitée plusieurs fois. Utilisez un évaporateur rotatif à 55 degrés Celsius pour concentrer le FA à un volume d’environ 15 millilitres et transférez complètement tout le volume de concentré de FA dans un tube de centrifugeuse en plastique de 50 millilitres. Sécher l’échantillon à 60 plus ou moins trois degrés Celsius à séchage constant dans le four de séchage et transférer le tube au dessiccateur pour refroidir.
Lorsque l’échantillon a refroidi, utilisez une spatule pour gratter l’AF extrait sur un morceau de papier pesé pré-pesé et déterminer le rapport de cendres, le poids de l’AF extrait et le pourcentage d’AF pur dans l’échantillon original, comme démontré pour l’acide humique. Dans ce tableau, les données de précision pour la méthode d’extraction de l’HA et de l’HFA à partir d’échantillons commerciaux liquides avec des concentrations très différentes d’HA et de HFA sont présentées. L’écart-type résiduel pour l’AH était inférieur à celui de l’HFA, mais l’écart-type résiduel moyen de l’HFA sur trois échantillons liquides était de 6,83 %, ce qui indique un degré élevé de précision.
Le ratio de Horowitz était également supérieur à deux pour une seule des analyses HFA. Dans ce tableau, les données de précision pour l’extraction de l’AH et du HFA à partir de trois échantillons de minerai humique sont présentées. Semblable à l’analyse précédente, à l’exception du HFA extrait du minerai deux et de l’HA du minerai trois, tous les rapports de Horowitz étaient inférieurs à deux, démontrant le haut degré de précision de cette méthode pour l’extraction de HA et HFA à partir d’échantillons de minerai humique.
Dans cette analyse, aucun additif biostimulant végétal n’a été observé pour affecter de manière significative la récupération de l’HA ou de l’HFA. Dans ces tableaux, les récupérations d’HA et de HFA à partir d’échantillons liquides qui ont stimulé les produits commerciaux à très faibles concentrations sont montrées. Les récupérations ont été excellentes, allant de 88% à 97% pour l’AH, et de 92% et 104% pour l’HFA, mais indiquant également la nécessité d’effectuer des réplications en laboratoire.
Suite à cette procédure, les acides humique et fulvique secs obtenus peuvent être utilisés à des fins de caractérisation, tels que le carbone 13 et la résonance électronique RMN protonique, et la spectrométrie de masse à ultra-haute résolution, entre autres techniques utiles. Et cela peut être utilisé pour la caractérisation de la chimie de l’humus, ainsi que pour un outil utile pour approfondir la relation structure-activité avec la forme physique de la plante et les mécanismes de défense sous-jacents des plantes.
