Name: imaging intranuclear actin rods in live heat stressed drosophila embryos
Uploaded: 2020-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
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著者らは、ソカック研究所でこの技術のパイオニアを助けたリリウ・ジェンとゼングイ・シューと、分析を支援したハサン・シーデの作品を感謝して認めている。この研究のための仕事はNIHからの助成金によって資金を提供される(R01 GM115111)。

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	<li>Figard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin-mediated+Actin+Stress+Response+is+maladaptive+in+heat-stressed+embryos.">Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos.</a> Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).</li><li>Ashworth, S. 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利益相反は宣言されていません。

この方法の意義は、ショウジョウバエ胚21、22、23、24、25、26、27におけるマイクロインジェクションの確立されたプロトコルを利用して、ASRおよび付随するアクチンロッドアセンブリに関する新しい研究を可能にすることです。生きた胚にG-アクチンレッドを注入する主な利点は、ASRが様々な文脈下で研究できることである。将来の研究のために、これらの文脈は、変異型スクリーンの一部として他の遺伝子型の胚を注入するか、酸化ストレス4、32などの異なるストレス状態に注入された胚を暴露することを含むかもしれない。ここでは詳細には説明しませんが、この注射技術は、核酸、他のタンパク質、薬物および指標染料(例えば、21、22、23、24、32)を注射してASRを研究するように修飾することもできる。したがって、この方法は、ASRを誘発するストレスの範囲を同定し、ASR中の細胞応答をさらに特徴付け(例えばミトコンドリア活性の変化)、および核内アクチン棒集合体の基礎となる新しい分子およびメカニズムを明らかにするための多くのアプローチを提示する。
プロトコルのいくつかの重要なステップには次のものが含まれます:ステップ3.8では、胚は正常な注射と最良の胚の健康を確保するために適切に乾燥する必要があります。乾燥時間は、実験室の周囲温度と湿度に依存するので、胚を処理するためのこのパラメータを確立するために、最初に中性pHバッファを用いて取り付け、乾燥、および注入を練習することが推奨されます。ステップ4.5では、マイクロニードルおよび注入設定を微調整して、十分なG-アクチンレッド を胚に注入できるようにする必要があります。あまりにも少ないG-アクチンレッド が胚に注入されると、アクチンロッドの形成が遊離アクチン1の濃度に依存するため、アクチンロッドが容易に可視化されない場合がある。また、蛍光強度がバックグラウンド蛍光を克服するのに十分な高さがないため、十分なG-アクチンレッド 注入がない場合、FRAP実験から一貫した結果を得ることは困難です。したがって、新しい針をロードして使用するたびに、気泡のサイズを調整することが重要です。G-アクチンレッド は粘性があり、マイクロニードルの中で詰まりやすい。時々、これは胚に可変量のG-アクチンを注入することにつながる。マイクロニードルが詰まって高圧でマイクロニードルをクリアできない場合は、マイクロニードルの先端をさらに壊すか、新しいマイクロニードルをロードして新しい胚のセットを注入する必要があるかもしれません。最後に、ステップ4.11では、胚を高温で、かつASRが誘導され、ロッドが1を形成するのに十分な時間の間、インキュベートされなければならない。すべてのインキュベーターの温度は常に監視されるべきであり、インキュベーターからインキュベーターに胚を移す時間は限られており、タイマーはすべてのインキュベーションに使用されるべきです。その他の考えられる問題は、トラブルシューティングのヒントとともに 表 2 に示されています。
このプロトコルの1つの大きな制限は、注射、インキュベーションおよびイメージング中に胚の健康を維持するために例外的な注意を払わなければならないということです。このプロトコルは、胚の健康を最大化するように設計されており、重要な実践により、研究者は胚の発達が温度31あたり期待される速度で進行してプロトコルのすべてのステップを完了することができる。プロトコルの第2の制限は、かなり高価であり、すべてのフライラボのための一般的な機器ではないマイクロインジェクションリグの必要性です。しかし、隣接する実験室が他の胚(例えば、ゼノプス、ゼブラフィッシュ、およびカエノハブディティス・エレガンス)または付着細胞を注入するために装備されている場合、使用される注射リグはショウジョウバエ注射に適している可能性が高い。その場合、ピペットクックブック29のガイドラインに従って、ショウジョウバエ胚に針の形状のみを適合する必要があります。あるいは、市場に安価なミコインジェクターオプション(例えば、アナログマイクロインジェクター)があり、注入リグを組み立てるコストを大幅に削減することができます。

このプロトコルは、誘導アクチンストレス応答(ASR)1を受けている熱ストレス胚における核内アクチン棒の集合体を可視化するためにG-アクチンレッドを注入する方法を説明する。我々は、胚において形態形成の破壊および生存率の低下をもたらすASRの研究を支援するためにこのプロトコルを開発し、成人のヒト細胞型は腎不全2、筋筋筋症3、アルツハイマー病およびハンチントン病4、5、6、7、8を含む病理に関連している。このASRは、ヒートショック9、10、11、酸化ストレス4、6、および異常ハンチンチンまたはβアミロイドオリゴマー化4、5、6、7、9、13、14、15、16を含む多数の細胞ストレスによって誘発される。ASRの特徴は、アクチン相互作用タンパク質のストレス誘発過活性化によって駆動される細胞質または影響を受ける細胞の核のいずれかに異常なアクチン棒の組み立てであり、Cofilin1、5、6、10。残念ながら、ASRに関する重要な知識のギャップは残っています。例えば、アクチン棒の機能は知られていない。私たちは、いくつかの細胞型の細胞質にロッドが形成される理由を理解していないが、他の人の核。また、ASRがストレスを受けている細胞や胚に対して保護的または不適応であるかどうかも明らかではない。最後に、コフィリンの過剰活性化やアクチンロッドアセンブリの根底にある詳細なメカニズムはまだ分かりません。したがって、このプロトコルは、生きたフルーツフライ胚の非常に難しい実験システムにおけるアクチンロッド形成およびダイナミクスを視覚化することによってASRを探査するための迅速かつ汎用性の高いアッセイを提供する。
生きているショウジョウバエ胚にG-アクチンレッドをマイクロインジェクトするプロトコルは、組織構築イベント中に正常な細胞質アクチン構造17のダイナミクスを研究するために最初に開発された。これらの研究では、G-アクチンレッド注射は、サイトカネシスまたは胃の17、18を含む胚の初期の発達過程に悪影響を及ぼさないことを発見した。その後、プロトコルを変更し、ASR1を受けている熱ストレス胚のアクチンロッドのイメージングを可能にするために、胚処理およびG-アクチンレッド注入を適応させる。G-アクチン赤注射以外の他の方法は、胚中のアクチンを視覚化するために使用することができる。これらの方法は、アクチンまたはウトロフィン-mCherry、ライフアクト、F-トラチンGFP、およびモージンGFPなどのアクチン結合タンパク質のドメインにタグ付けされた蛍光タンパク質(FP)を発現させることに依存している(19でレビュー)。しかし、これらのFPプローブを使用すると、いくつかのアクチン構造を安定または破壊する可能性があるため注意が必要であり、すべてのアクチン構造20に等しくラベルを付け、アクチンGFPの場合は、応力依存だけでなくアクチン濃度依存性のロッドアセンブリの分析に問題がある。したがって、G-アクチンレッドは、フライ胚のロッド研究のための好ましいプローブであり、胚の大きなサイズは、その容易な注射を可能にする。
このプロトコルのワークフローは、ショウジョウバエ胚21、22、23、24、25、26、27にタンパク質、核酸、薬物、および蛍光指標を注入するために使用されてきた他の確立されたマイクロインジェクション技術に似ています。しかし、ここでのG-アクチンレッドのマイクロインジェクションに続いて、胚は、ASRおよび核内アクチン棒集合体を誘導するために軽度の熱ストレスにさらされる。ハエや注入リグにアクセスできるラボでは、異なるストレスによる誘導や、異なる遺伝的背景での変調など、ASRに関する特定の研究ラインに対して、この方法を容易に実装し、適応可能にする必要があります。

<table><tbody><tr><td>Adenosine triphosphate (ATP)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A23835G</td><td>Component of G buffer</td></tr><tr><td>Apple juice, Mott&#039;s, 64 fl oz</td><td>Mott&#039;s</td><td>014800000344</td><td>Component of apple juice plates</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>Component of apple juice plates</td></tr><tr><td>Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite</td><td>KIK International</td><td>059647210020</td><td>For dechorionating embryos</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C1016500G</td><td>Component of G buffer</td></tr><tr><td>Cell strainer, 70 &amp;mu;m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>For collecting dechorionated embryos</td></tr><tr><td>Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>0000001994956</td><td>For imaging intranuclear actin rods</td></tr><tr><td>Desiccant</td><td>Drierite</td><td>24001</td><td>For desiccating embryos</td></tr><tr><td>Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom</td><td>Zeiss</td><td>4350649000000</td><td>For arranging embryos on agar wedge</td></tr><tr><td>Dissecting needle, 5 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>08965A</td><td>For arranging embryos on agar wedge</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1725</td><td>Component of G buffer</td></tr><tr><td>Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in</td><td>3M</td><td>021200010323</td><td>For making embryo glue</td></tr><tr><td>Embryo collection cage</td><td>Genessee Scientific</td><td>59100</td><td>For housing adult flies and collecting embryos</td></tr><tr><td>Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701D</td><td>For arranging embryos on agar wedge</td></tr><tr><td>Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW1004</td><td>For microneedles</td></tr><tr><td>Halocarbon oil 27</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H8773100ML</td><td>For hydration of embryos</td></tr><tr><td>Heated stage incubator</td><td>Zeiss</td><td>4118579020000, 4118609020000, 4118609010000</td><td>For confocal imaging</td></tr><tr><td>Lab Tissue Wipers, KimWipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>Lab tissue wipers</td></tr><tr><td>Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished</td><td>Zeiss</td><td>Discontinued</td><td>Injection microscope</td></tr><tr><td>Methyl-4-hydroxybenzoate</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H36471KG</td><td>Component of apple juice plates</td></tr><tr><td>Microinjector, FemtoJet4x</td><td>Eppendorf</td><td>5253000025</td><td>Microinjector</td></tr><tr><td>Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>For loading microneedles</td></tr><tr><td>Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment</td><td>Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)</td><td>Custom</td><td>For performing microinjections</td></tr><tr><td>Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P97</td><td>For pulling capillary tubes to make microneedles</td></tr><tr><td>Microscope cover glass 24x50-1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>For mounting embryos</td></tr><tr><td>Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037081</td><td>For mounting embryos for injection</td></tr><tr><td>n-Heptane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3601</td><td>Component of embryo glue</td></tr><tr><td>Objective, 10x</td><td>Zeiss</td><td>Discontinued</td><td>10x objective for injection microscope</td></tr><tr><td>Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS</td><td>Zeiss</td><td>4217679971711</td><td>40x water objective for confocal</td></tr><tr><td>Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm)</td><td>Zeiss</td><td>4208529871000</td><td>25x mixed immersion objective for confocal</td></tr><tr><td>Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA</td><td>Zeiss</td><td>4207829900799</td><td>63x oil objective for confocal</td></tr><tr><td>Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2</td><td>Daler-Rowney</td><td>038372016954</td><td>For transferring embryos</td></tr><tr><td>Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white</td><td>Kimberly-Clark</td><td>884266344845</td><td>For blotting cell strainer</td></tr><tr><td>Pasteur pipette, 5 3/4 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820A</td><td>For covering embryos with oil</td></tr><tr><td>Petri dish, glass, 100 x 20 mm</td><td>Corning</td><td>3160102</td><td>For humid incubation chamber</td></tr><tr><td>Petri dish, plastic, 60 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384092</td><td>For apple juice plates</td></tr><tr><td>Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>2231000604</td><td>For loading the microneedle</td></tr><tr><td>Pipette tip, xTIP4 250 &amp;mu;L</td><td>Biotix</td><td>63300006</td><td>For adding embryo glue to coverslip</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>VWR</td><td>55411050</td><td>For cutting agar wedge, tape, pipette tips</td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 &amp;mu;g)</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>APHR-A</td><td>G-actin^Red</td></tr><tr><td>Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps</td><td>Fisher Scientific</td><td>033377</td><td>For making embryo glue</td></tr><tr><td>Screw top jar, 16 oz</td><td>Nalgene</td><td>000194414195</td><td>For desiccating embryos</td></tr><tr><td>Stage micrometer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>602104PG</td><td>For calibrating volume of G-actin injection</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>840971KG</td><td>Component of apple juice plates</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T15031KG</td><td>Component of G buffer</td></tr><tr><td>Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz</td><td>Lesaffre Yeast Corporation</td><td>117929157002</td><td>Component of yeast paste</td></tr></tbody></table>

imaging intranuclear actin rods in live heat stressed drosophila embryos

このプロトコルの目的は、熱ストレスに続く生きたショウジョウバエメラノガスター胚に集まり、核内アクチン棒を可視化することです。アクチンロッドは、神経変性疾患を含むヒト病理に付随する保存された誘導アクチンストレス応答(ASR)の特徴である。以前は、ASRが形態形成の失敗と胚の発達の生存率の低下に寄与することを示した。このプロトコルは、イメージング、遺伝学および生化学に非常に適したモデルシステムにおけるアクチンロッドアセンブリおよびASRの基礎となるメカニズムの継続的な研究を可能にする。胚は回収され、注入のためにそれらを準備するためにカバースリップに取り付けられる。ローダミン共役球状アクチン(G-アクチンレッド)を希釈し、マイクロニードルに装填する。各胚の中心に1回の注射が行われる。注射後、胚は高温でインキュベートされ、核内アクチン棒は共焦点顕微鏡で視覚化される。光漂白(FRAP)実験後の蛍光回復はアクチン棒に対して行われ得る。細胞質中のアクチンが豊富なその他の構造も画像化することができる。我々は、G-アクチンレッドが内因性G-アクチンのように重合し、単独では正常な胚の発達を妨げないことを発見した。このプロトコルの1つの制限は、胚への重大な傷害を避けるために注射中に注意を払わなければならないということです。しかし、練習では、ショウジョウバエ胚にG-actinRedを注入することは、アクチンロッドを視覚化するための迅速かつ信頼性の高い方法であり、任意の遺伝子型のハエや低酸素症や酸化ストレスを含む他の細胞ストレスの導入で簡単に使用することができます。

胚処理の概略的なワークフローを 図 1に示し、代表的な実験のタイムテーブルを 表 1に示します。良好な実験結果の推定は、注入された10個の胚ごとに、見られる胚の少なくとも半分が正しい発達段階にあり、損傷を受けておらず、32°Cの熱ストレスを伴う堅牢なASRを示すということです。 このASRは、 図2A( 右パネル)の胚の代表的な表面図像に示すように、核内アクチン棒の組み立てによって証明される。アクチンロッドは、核内のいくつかの向き(画像平面に平行または垂直)で現れ、いくつかの焦点面を通して画像化することができます。それに比べて、18°Cでインキュベートされたコントロール胚はアクチン棒を表示しない(図2A、左パネル)。 図2Bに示すように、ロッドを含む原子核のパーセントを定量化できます。また、FRAP実験はロッド(図2C)に対して行われてもよい。FRAPデータの推奨定量方法を1 で参照し、アクチンロッドの漂白領域と未漂白領域に対する蛍光回収プロットの例を 図2Dに示す。
もし胚が注射によってひどく損傷を受けたり、実験中に乾燥しすぎたりすると、有糸分裂性非同期が観察され、細胞化が中断される。時には、胚に十分なアクチンを注入できなかったために棒が見えないことがあります。この場合、G- アクチンレッド注入量が500pL(ステップ4.5でマイクロメーターで測定)であることを確認し、この量が各胚マイクロインジェクションの間にG-アクチンレッド バブルのサイズを確認するために周囲の油にテスト注入を行うことによって胚間で一貫していることを確認する。さらに、ロッドの視覚化を確実にするために、ロッドアセンブリが可逆的な1 であり、胚が30分以上32°C未満の温度に保たれている場合はロッドが分解できるため、ステップ5.4で湿度の高いチャンバーから採取されると、カバースリップを追加し、胚を加熱顕微鏡ステージに移動させます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61297/61297fig1.jpg"> 図1:実験中の胚処理の概略図。(1)胚採取カップに入った大人のハエは、リンゴジュース寒天プレートに胚を置く。(2)胚は1:1漂白剤:蒸留水でデコリオネートされ、回収バスケットに注ぎ、蒸留水で十分に洗浄して漂白剤や破片を除去する。(3)胚は、スライド上の長方形のリンゴジュース寒天ウェッジに絵筆で移され、寒天の端に面した後ろ領域を持つ頭から尾に、その側面に配置されます。(4)ガラスカバースリップ(オレンジ)の5 x 50mm領域は「胚接着剤」でコーティングされ、寒天に配置された胚の列にそっと押し下げてカバースリップに付着する。(5) 胚を覆うカバースリップは、胚が上向きになるように反転する。胚はスクリュートップジャーに乾燥する。(6)乾燥後すぐに、カバースリップはスライドにテープでつながれ、胚は上を向き、胚はHalocarbon 27油で覆われる。(7) あらかじめ用意されたG-アクチンレッドを搭載したマイクロニードルを使用して、各胚の腹側領域の中央に1回の注射を行い、針はカバースリップに平行に配置される。(8)注射後、胚は、湿ったラボ組織ワイパーで湿ったラボ組織ワイパー(18°C)または熱ストレス(32°C)で加湿したペトリ皿の中でインキュベートされる。(9)インキュベーション後、その上に胚が付いているカバースリップはスライドから取除かれる。(10)両面テープを2枚重ねて、縦半分にスライスし、最初のカバースリップで胚を取り巻く油の両側に置く。第2のカバースリップ(青)は、新しいイメージング表面を作成するために最初の上に置かれ、必要に応じて胚をカバーするために追加されるより多くの油のためのギャップを残すように相殺される。(11)反転した共焦点顕微鏡での画像撮影の場合、カバースリップサンドイッチは反転され、2番目のカバースリップは目的に向かう。イメージングはインキュベートされたチャンバーで行われ、アクチンロッドは各胚の核のいくつかの焦点面上で視覚化されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61297/61297fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61297/61297fig2.jpg"> 図2: 熱ストレス胚におけるアクチン棒の代表的な結果(A)アクチンロッドは、制御温度18°C(左パネル)でインキュベートされた胚では見られないが、32°C(右パネル)で熱ストレスを受けた胚の核に見られる。(B)代表的な実験からアクチン棒を有する核の割合の定量化。各ドットは、棒および核が画像領域全体で数えられた1つの胚を表す(n=18°Cで22胚、32°Cでn=23胚;誤差棒は標準偏差を示す)。不等分散を仮定した学生のt検定を使用して、p値を計算しました。(C)代表的な時系列はアクチン棒のFRAPを示す。漂白されたロッドの部分は白い矢印で示されます。プレ漂白剤は、漂白剤のステップの前に2 sです。時間=0sは漂白剤ステップであり、蛍光回復は60sポスト漂白剤まで追跡した。(D)プロットは、同じロッド内の未漂白領域と比較して、ロッドの漂白領域におけるアクチン蛍光の回復ダイナミクスを示す。ロッドは非常に安定しており、その中のアクチンはターンオーバーしません。したがって、回復は見られない。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61297/61297fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:推奨時刻表を含む実験ワークフローこの時刻表は、プロトコルの各ステップを完了するためにかかる予想時間を要約します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>順序</td>
			<td>ステップ</td>
			<td>各ステップに必要な時間</td>
			<td>説明</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1.1</td>
			<td>5日前</td>
			<td>胚の収集ケージを作る。リンゴジュース寒天プレートを注ぎます。</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>1.2-1.3</td>
			<td>2日前</td>
			<td>大人の雄と雌のハエとコレクションケージを設定します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>2.6 注</td>
			<td>1日前</td>
			<td>マイクロニードルを作るために毛細管を引っ張ります。</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>2.1-2.6</td>
			<td>1時間</td>
			<td>Gアクチンを準備します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>3.1</td>
			<td>30分</td>
			<td>ハエが卵を産むことを許可します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>3.2-3.10</td>
			<td>15~30分</td>
			<td>胚を収集、マウント、乾燥させる。胚を油で覆う。</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>4.1</td>
			<td>30分前</td>
			<td>湿度の高いインキュベーションチャンバーを準備します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>4.2-4.4</td>
			<td>1分</td>
			<td>マイクロニードルをロードします。</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>4.5-4.10</td>
			<td>10~20分</td>
			<td>G-アクチンの泡サイズを調整し、胚を注入する。</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>4.11</td>
			<td>30分-1+ h</td>
			<td>インキュベート/熱ストレス胚。</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>5.1-5.3</td>
			<td>1時間前に</td>
			<td>顕微鏡とインキュベーションステージをオンにします。</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>5.4-5.10</td>
			<td>5分</td>
			<td>イメージング用のカバーリップの間に胚を挟む。</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>5.11-6.6</td>
			<td>15分-1+ h</td>
			<td>胚中の核内アクチン棒の画像。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: トラブルシューティングの提案この表は、プロトコルの正常な完了を支援するためのトラブルシューティングの推奨事項を示しています。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>潜在的な問題</td>
			<td>提案</td>
		</tr>
<tr>
<td>ハエは十分な胚を産まない。</td>
			<td>カップを5日前までに設定します(ステップ1.1~1.3を参照)。産卵を奨励するために実験に至るまで、1日あたり3倍のプレートを交換します。ハエは30分ではなく1時間胚を産ませます。若い大人のハエとカップを設定します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>G-アクチンはマイクロニードルから排出されません。</td>
			<td>マイクロインジェクターの圧力と時間設定を高める。マイクロニードルチップをさらに破ります(ステップ4.5注を参照)。大きな下駄はクリアされないかもしれないので、新しい針をロードします。</td>
		</tr>
<tr>
<td>十分に小さいバブルサイズを較正することは困難です。</td>
			<td>圧力と時間の設定を調整します(ステップ 4.5 を参照)。マイクロニードルチップの開口部が大きすぎる可能性があるため、新しい針をロードします。</td>
		</tr>
<tr>
<td>胚は注入の間カバースリップの接着剤から解放する。</td>
			<td>ヘプタン溶液に両面テープを追加して、将来のカバーリップに合わせて「胚接着剤」の一貫性を調整します(ステップ3.5注を参照)。</td>
		</tr>
<tr>
<td>胚は温度インキュベーション中に乾燥する。</td>
			<td>スライドがインキュベーションチャンバー内のレベル(ステップ4.11を参照)であり、オイルが外に悪いかもしれないものに触れていないことを確認してください。胚に油の余分な滴を追加します。射出前乾燥時間を短くします(ステップ3.8を参照)。</td>
		</tr>
<tr>
<td>オイルは、第1および第2のカバーリップの間の胚を完全に覆うわけではない。</td>
			<td>カバーリップ間の小さな隙間にキャピラリー作用を介して余分な油を追加します(ステップ5.8注を参照してください)。</td>
		</tr>
<tr>
<td>核内アクチン棒は熱ストレスの胚では見えない。</td>
			<td>より大きな量のG-actinを注入する(ステップ4.5を参照)。射出後インキュベーション(ステップ4.11参照)と撮像チャンバの両方の温度が32°Cであることを確認する(ステップ5.3参照)。</td>
		</tr>
<tr>
<td>G-アクチンの大きな気泡は、胚の注射部位の周りに見える。</td>
			<td>G-actinの少量を注入する(ステップ4.5を参照)。胚乾燥時間を長くして、胚内部に注入されたアクチンのより良い保持を促進する(ステップ3.8を参照)。</td>
		</tr>
</tbody></table>

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Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

このプロトコルの目的は、熱ストレスに続いて、ショ ウジョウバエ 胚および画像核内アクチン棒集合体にローダミン共役球状アクチンを注入することです。

ライブ熱ストレスショ ウジョウバエ 胚における核内アクチンロッドのイメージング

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

imaging-intranuclear-actin-rods-live-heat-stressed-drosophila

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

3.4K ビュー.  Baylor College of Medicine. このプロトコルの目的は、熱ストレスに続いて、ショ ウジョウバエ 胚および画像核内アクチン棒集合体にローダミン共役球状アクチンを注入することです。

ビデオ: Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

のアップライトイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;エッグチェンバース

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

発生生物学

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

神経科学

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

内イメージングカルシウム<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵活性化で

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

生体内でショウジョウバエの蛹の筋腱の形態形成の観察

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and computational modeling to classify and compare biological processes. Although cell culture model systems are great for high content imaging, high throughput studies of cell morphology suggest that ex vivo cultures are limited in recapitulating the morphological complexity found in cells within living organisms. As such, there is a need for a scalable high throughput model system to image living cells within an intact organism. Described here is a protocol for using a high content image analyzer to simultaneously acquire multiple time-lapse videos of embryonic Drosophila melanogaster development during the syncytial blastoderm stage. The syncytial blastoderm has traditionally served as a great in vivo model for imaging biological events; however, obtaining a significant number of experimental replicates for quantitative and high-throughput approaches has been labor intensive and limited by the imaging of a single embryo per experimental repeat. Presented here is a method to adapt imaging and microinjection approaches to suit a high content imaging system, or any inverted microscope capable of automated multipoint acquisition. This approach enables the simultaneous acquisition of 6-12 embryos, depending on desired acquisition factors, within a single imaging session.

Presented here is a protocol to microinject and simultaneously image multiple Drosophila embryos during embryonic development using a plate-based, high content imager.

ショウジョウバエ胚の調製と、自動高コンテンツアナライザを用いた生細胞顕微鏡のための微小注入

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

サブセルラー解像度で手つかずのショウジョウバエの幼虫の in vivoイメージングで

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

生物学

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;精巣

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

ショウジョウバエの神経筋接合部および筋細胞における微小管ネットワークの表示

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

著者スポットライト:ショウジョウバエの神経筋接合部における微小管ネットワークの理解 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

ライブ熱ストレスショウジョウバエ胚における核内アクチンロッドのイメージング

要約

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のアップライトイメージング

で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

内イメージングカルシウム

生体内でショウジョウバエの蛹の筋腱の形態形成の観察

ショウジョウバエ胚の調製と、自動高コンテンツアナライザを用いた生細胞顕微鏡のための微小注入

サブセルラー解像度で手つかずのショウジョウバエの幼虫の in vivoイメージングで

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

ライブ熱ストレスショ ウジョウバエ 胚における核内アクチンロッドのイメージング

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で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

内イメージングカルシウム

生体内でショウジョウバエの蛹の筋腱の形態形成の観察

ショウジョウバエ胚の調製と、自動高コンテンツアナライザを用いた生細胞顕微鏡のための微小注入

サブセルラー解像度で手つかずのショウジョウバエの幼虫の in vivoイメージングで

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

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精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

ライブ熱ストレスショウジョウバエ胚における核内アクチンロッドのイメージング