このプロトコルは、1つのイメージングセッション内で複数の胚を同時に取得することを可能にする。サンプル調製は高含有アナライザーを用いてマルチポイント取得に適合しているが、このプロトコルを用いて調製したサンプルは、マルチポイント取得が可能な任意の反転顕微鏡で画像化することができる。まず、卵ピッカーツールを使用して、素晴らしいプレートのきれいなセクションに15〜20個の胚の2列を整理します。
前部および後端に対して同じ方向に彼らの腹側の胚を合わせる。スペーサーをカバースリップに付着させ、露出したカバースリップガラスのインセットにヘプタンを10マイクロリットル引き上げてください。接着剤が乾燥している間、カミソリの刃を使用して、2列の胚の周りに長方形をカットします。
最初の長方形の横に 2 つ目の長方形を切り、ステンレススチールヘラの直線エッジ側で 2 番目の長方形を削除します。最初の長方形の下にヘラのまっすぐな端を慎重にスライドさせて取り除きます。次に、3.5センチメートル皿の外側に胚を入れた切り抜きを置きます。
ステレオ顕微鏡の下で、調製したカバースリップを胚の上に下げ、2列の胚を接着剤に静かに押し込みます。マイクロインジェクションを行わない場合は、シリコーンスペーサーを上に途中で1対1のハロカーボンオイル700をハロカーボンオイル27で充填する。4 スライド プレート アダプタの下端に両面テープを並べます。
これにより、イメージング中にスライドが移動するのを防ぐことができます。テープを対物レンズのパスに入れないようにしてください。カバースリップを4スライドプレートアダプターに取り付けます。
胚をマイクロインジェクトする場合は、乾燥およびマイクロインジェクション中にカバースリップの底が汚れないように、スライドの上に胚を含むカバースリップを置きます。胚を5〜10分間乾燥させ、その後すぐに1対1のハロカーボンオイル700をハロカーボンオイル27で覆い、シリコーンスペーサーを上の途中で満たす。拡張ローディングチップを使用して、約2マイクロリットルの注射剤を使用して2つまたは3つのマイクロインジェクション針をロードします。
マイクロインジェクターに針を取り付け、先端の途中でプランジャーを押し下げ、ガラス毛細血管内部の空気圧を上昇させます。ガラスの針をガラススライドに下げ、針の先端を新しい9番のカミソリで切り、45度の角度で切断して鋭い開いた先端を作ります。注射剤は、針から流れ出ることなく、先端の底まで流れ落ちるべきです.
針の先端に20マイクロリットルのハロカーボンオイルを慎重に加え、45度の角度で開き直します。注射剤は急速に流れ始める必要がありますので、プランジャーを引き込み、圧力を調整することを忘れないでください。マイクロマニピュレータを使用して、針を視野の中心に配置します。
その後、針を持ち上げ、その下からガラススライドを取り外します。マイクロインジェクション針の下に、ステレオ顕微鏡のステージに胚を置き、50倍の倍率でそれらに焦点を当てます。それは胚と同じ焦点面に入るまで針を下げます。
片手でスライドを移動し、マイクロインジェクターをもう一方の手で操作し、一列の胚を注入する。針を上げてスライドを180度回転させ、胚の2列目をマイクロインジェクション針に露出させます。針を下げ、胚の2列目を注入する。
このプロトコルは、ショウジョウバエ胚における有糸分裂の間に小管の小管の役割を調べるために使用された。ER再編成に対するいくつかのマイクロ注入薬物治療の効果を定量的に比較した。新しい微小管重合を防ぐコルヒチンは、有糸分裂時にスピンドル極へのERの局在を大幅に減少させることがわかった。
32個の胚に対してタイムラプス画像データを取得した。平均および最大強度の測定値は、カスタム MATLAB スクリプトを使用して、関心のある 12,800 領域から分析されました。このプロトコルを初めて試す際は、1 つのステップで時間がかかりすぎないようにしてください。
実験を行う前に、このプロトコルを段階的に実行してください。我々のサンプル調製方法は、1回の実験中に複数の胚を同時に取得することを容易にし、定量分析のための十分な実験複製を生成する。このプロトコルは、発達発生学が定性的なものから定量的な画像化実験に移行するのを助けることができる。
1回のイメージングセッション内で複数の胚を画像化する機能は、複製間の実験的ノイズも排除します。
