てんかんは一般的な神経疾患です。鼻皮質海馬組織ノミスティックスライスは、生体内てんかんに似ており、てんかん発生の元生体モデルとして使用できる進化するてんかん様イベントを描いています。このシステムは、てんかん発生のダイナミクスと進行を監視し、この脳病理の潜在的な治療目標をスクリーニングするための優れたツールです。
私と一緒に手順を示すのは、私の学生フランシスコ・メダとマファルダ・カルヴァーリョです。出生後6日目から7匹のスプレイグ・ドーリーの子犬に脳を収穫するには、まず5ミリリットルのGBSSで頭を3回洗う。バイオセーフティキャビネットで作業し、鋭い鉗子をしっかりと目のソケットに挿入して頭を所定の位置に保持し、薄い先端はさみを使用して脊椎の房から前頭葉までの正中線に沿って頭皮を切断します。
同じ方法で頭蓋骨を切り取り、脳横裂きに沿って、頭蓋骨の破片を離れて移動するために湾曲した長い鉗子を使用します。嗅球を捨て、5ミリリットルの冷たいGBSSを含む60ミリメートルのプレートに脳の後ろ側を移すためにスパチュラを使用してください。小脳に細かい鉗子を挿入し、慎重に半球を開くために正中線に沿ってへらを挿入します。
短い湾曲した鉗子を使用して、海馬の構造に触れることなく、海馬を覆う余分な組織を慎重に取り除き、各海馬の下に切り取ります。一度に海馬側を上に1つの半球を移動し、フィルターペーパーの上に互いに平行にします。半球をブレードに垂直にした組織チョッパーにフィルターペーパーを置き、半球を350ミクロンのスライスに切ります。
5ミリリットルの冷たいGBSSを含む新しいペトリ皿にスライスしたティッシュを移し、丸い先端電極を使用して、構造的に無傷の鼻皮質と海馬でサンプルのみを保持するスライスを慎重に分離します。DGおよびCA領域は、内膜および内皮質領域と同様に完全に定義されるべきである。ヘラと丸い先端電極を使用して、ウェルあたり1.1ミリリットルの培養培地を含む6ウェルプレートの適切な数のウェルに、個々のインサートに最大4つの無傷のスライスを配置します。
P20ピペットを使用して、各スライスの周りから余分な解剖媒体を取り除きます。プレートを細胞培養インキュベーターに入れる。2~ 3 日ごとにメディアを変更します。
フォースを使用して、インサートを持ち上げます。対応するウェルから培地を吸引し、挿入物を所定の位置に戻します。P1000ピペットを使用して、新鮮な37度の摂氏培地を各ウェルに1ミリリットル加えます。
閉回路で電気生理学のセットアップを準備します。インターフェースタイプチャンバの流量が毎分2ミリリットルに設定されていることを確認し、炭水化物-牛弁を開きます。システム内の水位を確認し、余分な媒体を排出するために、インターフェイス記録室にフィルターペーパーの一部を置きます。
レンズクリーニング用紙をフレームの下に置いて、スライスに媒体を供給し、温度コントローラ、アンプ、マイクロマニピュレータをオンにします。注射器を使用して、作りたての人工脳脊髄液をガラス電極にロードします。ガラス電極を受電電極に入れ、インターフェイスチャンバーの温度が摂氏37度で安定するのを待ちます。
バイオセーフティキャビネットで作業し、インサートを60ミリメートルのプレートに入れ、ミディアムを落とします。鋭利な刃を使用して、インサートからスライスを切り取り、海馬を右下にインターフェイスチャンバーに置き、受信電極をCA3ピラミッド型セル層に入れ、連続集録プロトコルを開始し、スライスを30分間記録します。ヨウ化プロピジウム取り込みアッセイを行うために、バイオセーフティキャビネットで働く。
インサートをウェルから持ち上げ、ヨウ化プロピジウムを培地に加え、井戸当たり2マイクロモルの最終濃度にします。チップを井戸に戻す前にゆっくりとプレートを攪拌し、スライスの下に泡がなさ注意してください。すべてのスライスが処理されたら、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。
スライスの免疫染色については、ヨウ化プロピジウムインキュベーションの終わりに、各ウェルの底部から培地を吸引し、各インサートの上下に4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットルを加える。室温で1時間後、スライスを1回10分間2回洗浄し、1回のPBSを1ミリリットルで洗浄し、疎水性ペンを使用して顕微鏡スライドに2つの長方形を描きます。鋭い刃を使用して、挿入物からスライスをカットし、各長方形に1つのスライスを配置します。
パーメビレーションブロッキング溶液を各スライスに加えて、室温で3時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、一晩4度摂氏インキュベーションのために各スライスに関心のある一次抗体を加える。翌朝、PBS-Tweenでスライスを1回10分間3回洗浄し、適切な二次抗体でスライスを室温で4時間インキュベートします。
その後、デモンストレーションしたようにスライスを洗い、各スライスに50マイクロリットルのHoechst溶液を加え、室温で20分間インキュベーションします。Hoechstインキュベーションに続いて、スライスを再び洗い、それぞれに50マイクロリットルの取り付け媒体を加え、スライスの上にカバースリップを置き、マニキュアで密封します。スライドを室温で24時間乾燥させた後、共焦点顕微鏡によるヨウ化プロイドと免疫染色を可視化します。
鼻皮質海馬の組織性のスライスは、体外で7日間で混合間およびイクタル様の活動を描いています。14日間のインビトロでは、自発的な活動は、1分以上続くイクタルイベントでインビトロで21日で圧倒的なイクタル活動に進化するictal放電によって特徴付けられる。神経マーカーNeuNに対するヨウ化プロピジウム取り込みおよび免疫体化学は、海馬のすべての領域で14日間でかなり増加するインビトロスライスの7日間でいくつかの神経細胞死を明らかにした。
インビトロで7日間で、低いCD68発現を有するミクログリアがIba1陽性CD68陽性反応性ミクログリアよりも豊富である。一方、14日間インビトロでは、海馬のすべての領域で、Iba1陽性CD68陽性アモエボイドM1ミクログリアは、低いCD68発現を有するミクログリアを超える。14日間のインビトロで、Iba1陽性CD68陽性細胞の一部を、ハイパービッフェリン外観を特定することができ、M2抗炎症ミクログリア表現型の可能性を示唆している。
7日間のインビトロでは、CD3の発現はほとんど検出不能であり、14日間のインビトロスライスでは、肥大性グリア性フィブリリン酸タンパク質陽性CD3陽性アストロサイトが観察され、A1アストロサイトの進行的活性化を示唆する。細心の注意を払って鼻皮質海馬スライスを準備します。スライス中にスライスの完全性を損なう可能性がありますので、海馬の上の余分な組織を取り除くことを確認してください。
構造的な欠陥は、スライスの実行可能性に悪影響を及ぼします。実証されたアプローチに加えて、ウエスタンブロット分析、リアルタイムPCRおよびELISAなどの多数のアッセイをこのシステムに適用して、てんかん発生に関する特定の質問に対処することができます。
