Epilepsi yaygın bir nörolojik hastalıktır. Rhinal korteks-hipokampus organotipik dilimler, in vivo epilepsiye benzeyen ve bu nedenle epileptogenezin ex vivo modeli olarak kullanılabilen gelişen epileptik benzeri olayları tasvir eder. Bu sistem gerçekten de epileptogenezin dinamiklerini ve ilerlemesini izlemek ve bu beyin patolojisi için potansiyel terapötik hedefleri taramak için mükemmel bir araçtır.
Benimle prosedürleri gösteren öğrenciler Francisco Meda ve Mafalda Carvalho olacak. Beyni doğum sonrası altı günden yedi Sprague-Dawley yavrusuna kadar toplamak için, önce başı beş mililitre GBSS'de üç kez yıkayın. Bir biyogüvenlik kabininde çalışarak, başı yerinde tutmak için göz yuvalarına keskin forsepsler yerleştirin ve kafa derisini omur forameninden ön loblara kadar orta çizgi boyunca kesmek için ince uç makası kullanın.
Kafatasını aynı şekilde ve serebral enine çatlak boyunca kesin ve kafatası parçalarını birbirinden ayırmak için kavisli uzun uzuna çarpmalar kullanın. Koku ampullerini atmak ve beyin dorsal tarafını beş mililitre soğuk GBSS içeren 60 milimetrelik bir plakaya aktarmak için bir spatula kullanın. Beyinciğin içine ince tokmaklar yerleştirin ve yarımküreyi dikkatlice açmak için spatulayı orta çizgi boyunca yerleştirin.
Hipokampus yapısını dokunmadan hipokampusu kaplayan fazla dokuyu dikkatlice çıkarmak için kısa kavisli önkseçimler kullanın, ardından her hipokampüsün altını kesin. Hipokampus tarafında bir kerede bir yarımküreyi bir filtre kağıdı parçasına yukarı ve birbirine paralel olarak aktarın. Filtre kağıdını, yarımküreleri bıçağa dik olan bir doku helikopterine yerleştirin ve yarımküreleri 350 mikron dilim halinde kesin.
Dilimlenmiş dokuyu beş mililitre soğuk GBSS içeren yeni bir Petri kabına aktarın ve dilimleri sadece yapısal olarak bozulmamış bir ren korteksi ve hipokampus ile tutan dilimleri dikkatlice ayırmak için yuvarlak uçlu elektrotlar kullanın. DG ve CA alanlarının yanı sıra entorhinal ve perirhinal korteks bölgeleri de mükemmel bir şekilde tanımlanmalıdır. Kuyu başına 1,1 mililitre kültür ortamı içeren altı kuyulu bir plakanın uygun sayıda kuyusunda tek tek kesici uçlara dört adede kadar sağlam dilim yerleştirmek için bir spatula ve yuvarlak uçlu bir elektrot kullanın.
Her dilimin etrafındaki fazla diseksiyon ortamını çıkarmak için bir P20 pipet kullanın. Plakayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Ortamı her iki ila üç günde bir değiştirin.
Kesici ucu kaldırmak için tokmak kullanın. Ortamı ilgili kuyudan emiş ve kesici ucu yerine yerleştirin. Her kuyuya bir mililitre taze 37 santigrat derece orta eklemek için bir P1000 pipet kullanın.
Elektrofizyoloji kurulumunu kapalı bir devrede hazırlayın. Arabirim tipi odanın akış hızının dakikada iki mililitreye ayarlı olduğunu doğrulayın ve karbonhidrat-öküz vanasını açın. Sistemdeki su seviyesini kontrol edin ve fazla ortamı boşaltmak için arayüz kayıt odasına bir filtre kağıdı yerleştirin.
Dilime orta sağlamak ve sıcaklık kontrol cihazını, amplifikatörleri ve mikro manipülatörleri açmak için çerçevenin altına bir parça lens temizleme kağıdı yerleştirin. Yeni hazırlanmış yapay beyin omurilik sıvısı ile bir cam elektrot yüklemek için bir şırınna kullanın. Cam elektrodu alıcı elektroda yerleştirin ve arayüz odasındaki sıcaklığın 37 santigrat derecede stabilize olmasını bekleyin.
Bir biyogüvenlik kabininde çalışarak, kesici ucu bir damla orta ile 60 milimetrelik bir tabağa yerleştirin. Kesici uçtan bir dilim kesmek ve dilimi sağ altta hipokampus bulunan arayüz odasına yerleştirmek için keskin bir bıçak kullanın, ardından alıcı elektrodu CA3 piramidal hücre katmanına yerleştirin, sürekli alım protokolünü başlatın ve dilimi 30 dakika boyunca kaydedin. Propidium iyodür alma testini gerçekleştirmek için bir biyogüvenlik kabininde çalışın.
Kesici ucu kuyudan kaldırın ve propidium iyodürü orta ila kuyu başına iki mikromolar son konsantrasyonda ekleyin. Kesici ucu kuyuya geri yerleştirmeden önce plakayı yavaşça çalkala, dilimlerin altında kabarcık olmamasına dikkat edin. Tüm dilimler tedavi edildiğinde, plakayı hücre kültürü inkübatörüne döndürün.
Dilimlerin immünostainasyonu için, propidium iyodür inkübasyonunun sonunda, ortamı her kuyunun altından aspire edin ve her kesici ucun üstüne ve altına% 4 paraformaldehit mililitre ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat sonra, dilimleri 10 dakika boyunca iki kez ve yıkama başına bir mililitre PBS yıkayın ve mikroskop slaytlarına iki dikdörtgen çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın. Kesici uçlardaki dilimleri kesmek ve her dikdörtgene bir dilim yerleştirmek için keskin bir bıçak kullanın.
Oda sıcaklığında üç saatlik bir inkübasyon için her dilime permeabilizasyon engelleme çözeltisi ekleyin. Kuluçkanın sonunda, bir gecede dört santigrat derece inkübasyon için her dilime birincil ilgi antikorlarını ekleyin. Ertesi sabah, dilimleri PBS-Tween ile yıkama başına 10 dakika boyunca üç kez yıkayın ve dilimleri oda sıcaklığında dört saat boyunca uygun ikincil antikorlarla kuluçkaya bırakın.
Daha sonra, dilimleri gösterildiği gibi yıkayın ve oda sıcaklığında 20 dakikalık bir inkübasyon için her dilime 50 mikrolitre Hoechst çözeltisi ekleyin. Hoechst inkübasyonunu takiben, dilimleri tekrar yıkayın ve her birine 50 mikrolitre montaj ortamı ekleyin, ardından dilimlerin üzerine bir kapak yerleştirin ve oje ile kapatın. Slaytların oda sıcaklığında 24 saat kurumasını sağladıktan sonra, konfokal mikroskopi ile immünostaining ve propidium iyodür alımını görselleştirin.
Rhinal korteks-hipokampus organotipik dilimler, yedi günlük in vitroda karışık interiktal ve ictal benzeri aktiviteyi tasvir eder. 14 günlük in vitroda, spontan aktivite, bir dakikadan fazla süren ictal olaylarla 21 günlük in vitroda ezici bir iktal aktiviteye evrilen iktal akıntılarla karakterizedir. Nöronal belirteç NeuN'a karşı propidium iyodür alımı ve immünhistokimya, hipokampüsün tüm alanlarında 14 günlük in vitroda önemli ölçüde artan in vitro dilimlerde yedi günde bazı nöronal ölümler ortaya çıkardı.
Yedi günlük in vitroda, düşük CD68 ekspresyonlu ramified mikroglia, Iba1 pozitif CD68 pozitif reaktif mikroglia'dan daha boldur. 14 günlük in vitroda, hipokampüsün tüm alanlarında, Iba1 pozitif CD68 pozitif amipoid M1 mikroglia düşük cd68 ekspresyonu ile mikrogliayı aşıyor. 14 günlük in vitroda, hiper çarpma görünümüne sahip bazı Iba1 pozitif CD68 pozitif hücrelerin tam olarak tespit edilebilir, bu da M2 anti-enflamatuar mikroglia fenotip olasılığını düşündürmektedir.
Yedi günlük in vitroda, CD3 ekspresyonu zar zor tespit edilebilirken, 14 günlük in vitro dilimlerde hipertrofik glial fibril asidik protein pozitif CD3 pozitif astrositler gözlenebilir ve bu da A1 astrositlerinin ilerleyici bir aktivasyonunu düşündürür. Rhinal korteks-hipokampus dilimlerini aşırı özenle hazırlayın. Dilimleme sırasında dilim bütünlüğünü tehlikeye atabileceğinden hipokampüsün üzerindeki fazla dokuyu çıkardığınızdan emin olun.
Yapısal açık dilim canlılığını olumsuz etkileyecektir. Gösterilen yaklaşımlara ek olarak, epileptogenez ile ilgili belirli soruları ele almak için bu sisteme Batı blot analizi, gerçek zamanlı PCR ve ELISA gibi çok sayıda tahlil uygulanabilir.
