Эпилепсия является распространенным неврологическим заболеванием. Органотипические срезы ринальной коры-гиппокампа изображают развивающиеся эпилептические события, которые напоминают эпилепсию in vivo и поэтому могут быть использованы в качестве модели эпилептогенеза ex vivo. Эта система действительно является отличным инструментом для мониторинга динамики и прогрессирования эпилептогенеза, а также для скрининга потенциальных терапевтических мишеней для этой патологии головного мозга.
Демонстрировать процедуры со мной будут мои ученики Франсиско Меда и Мафальда Карвальо. Чтобы собрать мозг с послеродового дня от шести до семи щенков Спрэга-Доули, сначала промыть голову три раза в пяти миллилитрах СГБ. Работая в шкафу биобезопасности, твердо вставьте острые щипцы в глазницы, чтобы удержать голову на месте, и используйте тонкие ножницы, чтобы разрезать кожу головы вдоль средней линии от позвоночного цевья до лобных долей.
Вырежьте череп таким же образом и вдоль поперечной трещины головного мозга и используйте изогнутые длинные щипцы, чтобы раздвинуть части черепа. Используйте шпатель, чтобы отбросить обонятельные луковицы и перенести дорсальную сторону мозга вверх в 60-миллиметровую пластину, содержащую пять миллилитров холодного GBSS. Вставьте тонкие щипцы в мозжечок и вставьте шпатель вдоль средней линии, чтобы осторожно открыть полушарие.
Используйте короткие изогнутые щипцы, чтобы аккуратно удалить лишнюю ткань, которая покрывает гиппокамп, не касаясь структуры гиппокампа, затем разрезайте ниже каждого гиппокампа. Перенесите одно полушарие за раз гиппокампом стороной вверх и параллельно друг другу на лист фильтровальной бумаги. Поместите фильтровальную бумагу на измельчитель тканей с полусферами, перпендикулярными лезвию, и разрежьте полусферы на 350 микронных ломтиков.
Переложите нарезанную ткань в новую чашку Петри, содержащую пять миллилитров холодного GBSS, и используйте электроды с круглым наконечником, чтобы тщательно отделить ломтики, сохраняя только образцы со структурно неповрежденной ринальной корой и гиппокампом. Области DG и CA должны быть идеально определены, а также энторинальные и периринальные области коры. Используйте шпатель и электрод с круглым наконечником для размещения до четырех неповрежденных ломтиков на отдельные вставки в соответствующем количестве лунок шестияменной пластины, содержащей 1,1 миллилитра питательной среды на лунку.
Используйте пипетку P20, чтобы удалить лишнюю среду для рассечения вокруг каждого среза. Поместите пластину в инкубатор клеточной культуры. Меняйте среду каждые два-три дня.
Используйте щипцы, чтобы поднять вставку. Аспирировать среду из соответствующего колодца и поместить вставку обратно на место. Используйте пипетку P1000, чтобы добавить один миллилитр свежей среды 37 градусов Цельсия в каждую лунку.
Подготовьте электрофизиологическую установку в замкнутом контуре. Убедитесь, что скорость потока камеры интерфейсного типа установлена на уровне двух миллилитров в минуту, и откройте карб-быковый клапан. Проверьте уровень воды в системе и поместите лист фильтровальной бумаги в интерфейсную камеру записи, чтобы слить любую лишнюю среду.
Поместите лист бумаги для очистки линз под рамку, чтобы подать среду на срез, и включите регулятор температуры, усилители и микро манипуляторы. Используйте шприц для загрузки стеклянного электрода свежеприготовленной искусственной спинномозговой жидкостью. Поместите стеклянный электрод в принимающий электрод и дождитесь стабилизации температуры в интерфейсной камере при 37 градусах Цельсия.
Работая в шкафу биобезопасности, поместите вставку в 60-миллиметровую пластину с каплей среды. Используйте острое лезвие, чтобы вырезать срез из вставки и поместить срез в интерфейсную камеру с гиппокампом в правом нижнем углу, затем поместите принимающий электрод в слой пирамидальной ячейки CA3, инициируйте протокол непрерывного сбора и записывайте срез в течение 30 минут. Чтобы выполнить анализ поглощения пропидия йодида, работайте в шкафу биобезопасности.
Поднимите вставку из скважины и добавьте йодид пропидия в среде до конечной концентрации двух микромоляры на скважину. Медленно перемешиваем пластину, прежде чем поместить вставку обратно в колодец, заботясь о том, чтобы под ломтиками не было пузырьков. Когда все ломтики будут обработаны, верните пластину в инкубатор клеточной культуры.
Для иммуноокрашивания срезов в конце инкубации йодида пропидиума аспирируют среду со дна каждой лунки и добавляют один миллилитр 4%-го параформальдегида в верхнюю и нижнюю части каждой вставки. Через час при комнатной температуре вымойте ломтики два раза в течение 10 минут и по одному миллилитру PBS за стирку и используйте гидрофобную ручку, чтобы нарисовать два прямоугольника на слайдах микроскопа. Используйте острое лезвие, чтобы вырезать фрагменты из вкладыш и поместить по одному срезу в каждый прямоугольник.
Добавьте раствор для блокировки пермеабилизации на каждый ломтик для трехчасовой инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации добавьте первичные антитела, представляющие интерес, к каждому срезу для инкубации в четыре градуса Цельсия в течение ночи. На следующее утро промыть ломтики PBS-Tween три раза по 10 минут за одну стирку и инкубировать ломтики с соответствующими вторичными антителами в течение четырех часов при комнатной температуре.
После этого промыть ломтики, как показано на демонстрации, и добавить 50 микролитров раствора Hoechst к каждому срезу для 20-минутной инкубации при комнатной температуре. После инкубации Hoechst снова вымойте ломтики и добавьте к каждому из них 50 микролитров монтажной среды, затем поместите на ломтики и запечатайте лаком для ногтей. После того, как слайды высохнут в течение 24 часов при комнатной температуре, визуализируйте иммуноокрашивание и поглощение йодида пропидиума с помощью конфокальной микроскопии.
Органотипические срезы ринальной коры-гиппокампа изображают смешанную межиктальную и иктал-подобную активность на семь дней in vitro. На 14 днях in vitro спонтанная активность характеризуется иктальными разрядами, которые развиваются до подавляющей иктальной активности через 21 день in vitro с иктальными событиями, длящимся более одной минуты. Поглощение йодида пропидия и иммуногистохимия против нейронального маркера NeuN выявили некоторую гибель нейронов за семь дней срезов in vitro, которая значительно увеличивается через 14 дней in vitro во всех областях гиппокампа.
Через семь дней in vitro разветвленные микроглии с низкой экспрессией CD68 более распространены, чем Iba1-положительная CD68-положительная реактивная микроглия. В то время как через 14 дней in vitro, во всех областях гиппокампа Iba1 положительная CD68 положительная микроглия амебоида M1 превосходит микроглию с низкой экспрессией CD68. Через 14 дней in vitro некоторые Iba1-положительные CD68-положительные клетки с гиперрементификацией могут быть точно определены, что предполагает возможность фенотипа противовоспалительной микроглии M2.
Через семь дней in vitro экспрессия CD3 едва обнаруживается, в то время как через 14 дней срезов in vitro может наблюдаться гипертрофические глиальные фибриллярные кислые белки-положительные CD3-положительные астроциты, что предполагает прогрессирующую активацию астроцитов A1. Готовьте ломтики ринальной коры-гиппокампа с особой осторожностью. Обязательно удалите лишнюю ткань над гиппокампом, так как это может нарушить целостность среза во время нарезки.
Структурный дефицит негативно скажется на жизнеспособности среза. В дополнение к продемонстрированным подходам, множество анализов, таких как анализ вестерн-блот, ПЦР в реальном времени и ИФА, могут быть применены к этой системе для решения конкретных вопросов, касающихся эпилептогенеза.
