このプロトコルは、クラミジアの生成と分離に、発達プロファイルを変更するための独自のツールを提供し、最終的には発達サイクルを調節する遺伝子の同定を可能にする。この方法の主な利点は、クラミジア細胞型の発達をリアルタイムで追跡する能力と、クラミジアを分離する能力、および開発プログラムを変更する能力である。クラミジア・トラコマティス記者を変異体化するために、約3倍の10分の1から7番目の初等体を含むクラミジアストックを見た。
関心のあるレポータープラズマとペレットで変換され、思考は遠心分離によってストックされています。10秒間10%の電力で超音波処理を使用し、100マイクロリテラボの100マイクロリットルで素体を再中断し、得られた初体の懸濁液を2つの1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管の間で均等に分割します。50マイクロリットルの新しく調製したEMS代謝溶液を、突然変異誘発のためのクラミジアアリコートに加え、50マイクロリットルの空水代謝バッファーを、ストック突然変異誘発のためだけにクラミジアアリコートに加え、両方のサンプルを室温で20分間インキュベートします。
EMSは、取り扱い時に手袋を着用する既知の発がん性物質であり、廃棄前に24時間、すべてのEMS汚染された機器および媒体を1つのモル水酸化ナトリウムに浸します。卸売文化を設定するために、変異体化クラミジア・トラコメーターのイメージングと分離のために。種子6ウェルガラス底板は、6倍の10〜5番目のコスト7細胞で、1ウェルあたり完全な媒体の2ミリリットルで、5番目に10から5番目の24ウェルポリスチレンプレートを播種すると、1ミリリットルの完全な培地1ミリリットルの完全な培地で7細胞を生じる。
宿主細胞培養物に感染するために、変異体化されたフラミジア・トラコマティスが感染することを否定し、約6倍の10〜5番目の、変異体化された素体のガラス底板の5つのウェル。井戸あたり氷冷HBSSの1.5ミリリットルで。残りの井戸に感染し、1ウェルあたり1.5ミリリットルの氷冷HBSSで5番目の模擬変異原ゲン化素体に約20回、摂氏37度で15分間インキュベーションした後、37°CのHBSSで感染細胞を37度のヘパリン1ミリグラムで洗浄し、その直後にHBSrineの1ミリグラムで感染した。
ヘパリンで細胞を再び洗い、HBSSだけで2つのリンスをすぐに洗い、すべてのヘパリンが取り除かれるようにします。最後の洗浄後、37°Cのイメージング培地を4ミリリットルずつ加え、各ウェルに加えます。そして、37°C脱イオン水でインターウェルスペースを埋め、10時間細胞培養インキュベーターにプレートを置きます。
インキュベーションの最後に、顕微鏡ステージインキュベーターを5%の二酸化炭素、摂氏37度に設定します。そして、ステージインキュベーターに6つのウェルガラス底板を置きます。イメージングソフトウェアでは、高コンテンツスクリーニングプラグインを使用して6つのウェルプレートテンプレートを選択し、自動イメージングのフォーカスを設定し、GFBチャンネルで4%の強度で250ミリ秒、RFPチャンネルの密度で18%の密度に露出を設定するために、12の視野で構成されるイメージング位置リストを生成します。
そこで、イメージングサイクルでは、30分間隔で24時間、発達サイクルのキネティックスをキャプチャし、InFocusスライスの両側で終わるフォーカス範囲を持つ複数のZスタックを含むように画像キャプチャを設定し、イメージング用の相対Zを選択し、取得ウィンドウ内の複数のスライスを選択し、画像スタックファイルオプションを使用します。をクリックして、TIFF スタック ファイルとして保存するイメージを設定します。インクルージョントラックを識別するには、開発プロファイルを変更して、EMS画面のインポートセルを使用して、トラック統計のスポットからインクルージョントラックデータをインポートし、CSVファイルをPandaのデータフレームにインポートします。
計算セルを使用して、各トラックの早期および後期の両方のレポーターの最大式を持つ時間を計算し、半最大プロット セルでボケプロットパッケージを使用して、hctB prom の式に対して半分の最大表現に対する時間 2 の最大表現を視覚化します。ボケインタラクティブトラックIDエクスプローラを使用して、模擬処理された散乱雲の外に落ちる突然変異体母集団からの包含を識別する。アニメーション血球グラフにおけるプロモーター発現動態の変化を動的に可視化するために、hctBプロムに対するEOUプロムの発現強度をグラフ化した。
次に、アクルージョンロケータセルで、アニメーション化されたグラフからスナップショットを視覚化します。発達ニュートンを分離するために、対象物の包含から、識別された包含物を有するウェル上に視野を配置し、位相差差干渉対照白色光チャネル光源に針を渡し、針を視覚化し、595ナノメートル、励起チャネルを使用し、抽出用の素体を可視化する。微細な調整やマイクロマニピュレータを使用して、キャピラリー針を封入まで操縦し、針で包接を破裂させ、マイクロインジェクターを使用して毛細血管針先端に素体を引き込む。
抽出された素体を、毛細血管から単一のウェルに出し、24ウェルポリスチレンプレートで調製し、次の抽出のために新しい毛細血管針を使用する。各単離物の十分な膨張の後、感染した単層を1ミリリットルマイクロピップチップで破壊し、培地細胞の破片を移動させ、クラミジアを新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管に放出した。遠心分離によって収穫したクラミジアをペレットにし、75マイクロリットルの氷冷、スクロースリン酸グルタミン酸緩衝液中のペレットを再懸濁し、その後、3つの新しい1.5ミリリットルスクリューキャップマイクロ遠心チューブの間で包込懸濁液を均等に分割し、マイナス80でチューブを貯蔵して摂氏を読み取る。
変異原ISEDのイメージング用の宿主細胞培養をセットアップするために、1.6倍の10倍の7細胞を有する96ウェルガラス底板を播種し、1ウェル当たり100マイクロリットルの完全培地で培養した。宿主細胞単層が氷上で採取した変異クローンおよび野生型クラミジア株を融解し、1つの分離株につき1列を使用して、各変異体の2倍の連続希釈を行った後、各変異体の2倍の連続希釈を行う。感染感染は、野生型クラミジアを用いた残りのカラムを、約0.5の感染の多重度で、培養後10時間培養器にプレートを入れ、1未満の感染の多重度に対応する変異体分離物当たり3つのウェルを選択し、画像化位置リストを生成する。
井戸ごとに2つの視野から成ります。この散布図では、個々のクラミジア分離株からのEOUおよびhctBプロモーターの最大発現の半分までの時間は、クローンA3667およびB3858が、EOUプロモーターからより長い4hctBを有する最大発現を有する短い時間を産生するとして単離のために選出された。変化した動態を有するインクルージョンは、可視化、2つのプロモーターの動的遺伝子発現、およびアニメーショングラフのスナップショットを使用して、目的の包含の位置を同定することに基づいて同定することができる。
これらの代表的な可視化では、合計24個のインクルージョンが単離のために同定され、そのうち10個は微分動態を示し、3つの異なる表現型カテゴリーで再検査した際に、8つの分離株が感染後約24時間でEOUプロモーター発現を減少させた。A3667クローンによって示されるように、B3858は単離し、また、感染後約24時間で減少したEOUプロモーター発現を示した。しかし、hctBプロモーター発現の全体的な増加は、B3662単離に対し、EOUプロモーターからの蛍光の増加レベルを発現し、その後、両方のプロモーターで発現の突然の喪失が続いた。
変異型B3662の生きた細胞顕微鏡写真の分析は、宿主細胞のライシスが起こったことを明らかにし、この変異体に感染した細胞において、野生型感染細胞よりはるかに早く起こった。細胞型開発不足クラミジア回復は、これらの細胞が宿主を再感染することができないので、不可能であり得る。ゲノムワイド関連研究は、単離後に、発達遺伝子を同定するために、統計的相関を介して、代替プロモーターレポーターの組み込みと共に使用することができる。
この方法は、多数の遺伝的経路の調査、遺伝的回路機構、および他の細胞内病原体の解剖に拡張することができる。
