LPEはスコットランドのシニア·クリニカル·フェロー兼チーフサイエンティストオフィス（SCD/03）の支援を認めている。この作品は、LPE（089930）にウェルカムトラストプロジェクト無償資金によって賄われていた。 NARGはウェルカムトラストプログラムグラント（080088）と機器グラント（075470）（DeltaVision用）によって、およびFP7-2007から2013グラント（健康-F2-2010から260338-ALLFUN）によって賄われていた。我々は、有用サポートやアドバイスのために、特定のケヴィン·マッケンジーでは、アバディーンイメージング施設の大学に感謝したいと思います。

1℃、 albicansの成長と条件<ol><li>アミノ酸、1 mlの1 M NaOHを、10ミリリットルの1％（w / v）アデニン硫酸塩塩と20グラムテクニカル寒天（以前は11で詳述）を使用せずに6.9グラム酵母窒素塩基を加えることにより、SC-Ura寒天プレートを準備します。蒸留H 2 Oで900ミリリットルにボリュームを作るオートクレーブ、寒天を冷ましますが、固化した後、無菌条件下で50ミリリットル滅菌40％D-グルコースおよび50 mlの滅菌4パーセントのSC-浦ドロップアウトを追加するのに十分ではない。ミックス、ペトリ皿に注ぎ、冷却して凝固寒天プレートにしておきます。ストア寒天プレート5℃で使用時まで。 </li><li>ストリークC.カンジダ血清型菌株CAI4 + CIp10グリセロールストックから-80℃で保存し、SC-Ura寒天プレート上に。 </li><li> 30℃でプレートをインキュベート℃〜5℃までコロニーフォーム℃で保存</li><li>文化シングルC.カンジダは、5mlのSC-URA培地（1.1のようにレシピが、技術的な寒天なし）でコロニーと30℃で一晩インキュベート固定相Cを生成するために℃、200rpmでカンジダ 。 </li></ol> 2℃ でフルオレセインイソチオシアネート（FITC）を用いて染色アルビカンス <ol><li> 10μlのCを追加990μlのPBSにアルビカンス一晩培養した培養液（pH7.4）および血球計を用いて細胞数を実行します。 </li><li> Cの可視化を支援するために食作用アッセイ時アルビカンスは 、1×10 8℃を染色暗所で室温で10分間、0.05M炭酸塩-重炭酸塩緩衝液（pH9.6）に1 mg / mlのFITCを使用アルビカンス 。 </li><li>未結合のFITCを削除するには、Cを洗う1ミリリットル1×PBSで5分間3000×gで遠心分離で菌は 、1ミリリットル1×PBS中で上清とペレットを再懸濁しを削除します。 3回繰り返します。 </li><li> 1でペレットを再懸濁し×1×PBS中10 6細胞/μl。 </li></ol> 3。 J774.1マウスマクロファージ細胞株の作製<ol><li> 75cm 2の組織中のマクロファージJ774.1を維持DMEM培地で培養フラスコは、10％（v / v）ウシ胎児血清（FCS）、37℃で200 U / mlペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン°5％CO 2を使用したCを補充。初代マクロファージの調製は、詳細図12、図13の他の部分で説明されています。 </li><li>組織培養フラスコからJ774.1細胞をこすり取ると50 mlファルコンチューブに移す。細胞ペレットを得るために5分間600×gで遠心分離します。 </li><li> 10ミリリットルの予め温めたDMEM培地で上清とペレットを再懸濁しを削除します。 35ミリメートルガラスベースのイメージング皿に2ミリリットルDMEM培地で血球とプレートに1×10 6 J774.1マクロファージを用いて細胞をカウントする。 37℃で一晩インキュベート℃、5％CO 2で 。 </li><li>事前のイメージングに、2ミリリットルプリ温め補わCO 2の独立した培地（10％（v / v）ウシ胎児血清（FCS）、200 U / mlペニシリン/ストレプトマイシンおよび2mMのL-グルタミンを含む）を添加したDMEM培地を交換1μMのLysoTrackerレッドDND-99を含む。</li></ol> 4。ライブセルビデオ顕微鏡貪食アッセイ<ol><li>顕微鏡の選択は、局所的に利用可能なものにかかっているが、顕微鏡のセットアップが反転段、選ばれた汚れのために37℃、励起/発光フィルタ（FITCおよびTRITC）に加熱環境室をインクルードする必要があります。 </li><li>実験に先立って顕微鏡ヒーターの電源をオンにして、37まで温め環境制御室のための十分な時間を認め℃に安定させるためにチャンバ温度に要する時間は異なる顕微鏡のセットアップごとに異なります。 </li><li>顕微鏡とコンピューターの電源をオンにして、イメージングソフトウェアをロードします。顕微鏡ステージ上の撮像皿をマウントし、マクロファージJ774.1を見つけるためにピントを合わせます。透過光と露光時間の割合を調整することにより、TRITCやDIC画像の外観を最適化します。 </li><li>イメージング皿を取り外し、3×10 6のFITC-汚さCを追加トンへ·アルビカンス彼は料理。時間を記録しておくことでカンジダは、皿に追加されます。ステージに皿を返却し、必要に応じて、FITC画像の外観を最適化します。必要に応じて、ポイントリストを設定します。 </li><li>すべての点がフォーカスされているとチャンネルが最適化されているときに撮影を開始する。 FITC、TRITCやDIC画像で6時間分ごとにキャプチャします。 </li></ol>

<ol>
	<li>McKenzie, C. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Candida+albicans+cell+wall+components+to+recognition+by+and+escape+from+murine+macrophages.">Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages.</a> Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).</li><li>Mora-Montes, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+blocking+of+innate+immunity+cells+by+Candida+albicans+chitin.">Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin.</a> Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).</li><li>Keppler-Ross, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+yeast+by+murine+macrophages+requires+mannan+but+not+glucan.">Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan.</a> Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).</li><li>Vijayan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mincle+polarizes+human+monocyte+and+neutrophil+responses+to+Candida+albicans.">Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans.</a> Immunol. Cell Biol. , (2012).</li><li>Seider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation.">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).</li><li>Sheth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+status+of+the+C.+albicans+cell+wall+affects+the+efficiency+of+neutrophil+phagocytosis+and+killing+but+not+cytokine+signalling.">Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling.</a> Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).</li><li>Lewis, L. 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Biol. , (2012).</li><li>Mora-Montes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+macrophages+and+cell+wall+oligosaccharides+of+Candida+albicans.">Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).</li><li>McPhillips, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptotic+cell+phagocytosis+by+macrophages.">Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).</li><li>Erwig, L. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+phagosome+maturation+in+macrophages+and+dendritic+cells+mediated+by+Rho+GTPases+and+ezrin-radixin-moesin+(ERM)+proteins.">Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。 NGはギリアド·サイエンシズによる基礎研究のための無制限の助成金を受けています。 LEは、早期の薬剤開発におけるGSKのためのコンサルタントとして働いています。

ここで、マクロファージの食作用を研究するための生細胞ビデオ顕微鏡を使用するための方法が記載されている。ビデオ顕微鏡は、分析のための情報の複数の追加の層を提供しています。つの基本的な利点は、取り込みデータは6時間の観察期間を通していずれの時点（1つの実験から）を生成することができるということです。さらに重要なことは、記載された方法は、食作用の個々の段階の差分析を可能にします。我々は、例えば、示されていることで全体の取り込みの変化マクロファージ細胞株および初代マクロファージによるアルビのグリコシル化と形態形成変異体は、細胞-細胞接触一度標的細胞や貪食率に向かってマクロファージ遊走の変化7を確立されているいずれかの結果であることができます。 これらの実験を行う際に避けるために落とし穴がいくつかあります。まず最初に、それは実験proceを通して安定した環境条件を確保することが非常に重要であるdure。これは最高の実験を開始する前に、実験条件を数時間に設定されている環境室で達成される。ビデオの品質は関係なく、自動的にこのようにマニュアルフォーカス補正の必要性を排除し、機械的または熱変化のサンプルz位置を維持するために赤外線レーザーを使用し洗練されたモジュールに強く依存しています。 実験の拡張された性質を考えると、それは低露光時間を容易にする高度に蛍光マーカーを採用することで最小限に抑えることができ、レーザ光曝露と関連する光退色と光電効果を制限することが重要です。ここで説明されたFITC染色プロトコルは、迅速かつ信頼性の高いです。 FITCであるように非常に明るく、安定した汚れは、低露光時間が必要であり、これは、拡張タイムラプスムービーのFITC最適ですされています。しかし、我々は日常的にCalcofluorホワイトとPKH染料と同様のタグ付き生物を含む、様々なターゲットの汚れのさまざまな使用。 この研究中に、画像が6時間貪食アッセイで1分間隔で撮影した。画像間の間隔は、調査中のプロセスに応じて調整することができる。そのような小胞輸送など迅速なプロセスを調査するときにたとえば、間隔を小さくすることができる。最小の時間間隔は、顕微鏡やカメラの仕様によって制限されます。タイミングを調整するときに心に留めて、いくつかの考慮事項があります。まず、スナップショットの間隔を小さくすると、より少ない点が結像させることができると、ファイルサイズが大幅に増加されることを意味します。それどころか、あまりにも多くの画像の間隔を長くすると、ムービーが連続性を失うことになります。 このアプローチを適用することができる原理的には他の病原体と宿主細胞を瀕死の取り込みを調べた。例えば、我々は最近、シアロアドヘシン欠損マウスから骨髄由来マクロファージを大幅にシアリルカンピロバクター 8の付着及び貪食減少呈することが示されている。画像解析は、標的細胞の大きさの減少とともにますます困難になるしかし、目標サイズは、実現可能性のための重要な決定要因である。洗練された画像解析ソフトウェアは、迅速なビデオ顕微鏡分析のために不可欠であり、これは7個の細胞と全体の細胞集団の移行を研究するためのアルゴリズムの生成を容易にするための適切なバイオインフォマティクスのサポートと組み合わせなければならない。移行および個々のマクロファージC.albicans相互作用の分単位の分析のための洗練された画像解析ソフトウェアと組み合わせて、生細胞ビデオ顕微鏡、Cの複雑さにユニークな洞察を提供していますmacrophagによってアルビカンス貪食ES。他の病原体や貪食細胞（樹状細胞、好中球）を勉強すると、より詳細に、またはそのような上皮および内皮細胞層など、より生理的な表面上の画像、細胞間相互作用に3Dビデオ顕微鏡を開発するために、これらのメソッドを展開する巨大な可能性があります。この手法は、宿主 - 病原体相互作用の研究のツールの次の世代の一部であり、ダイナミックなプロセスの広範囲の詳細な空間的​​および時間的な情報を生成するのに役立ちます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>アミノ酸を含まない酵母窒素塩基</td><td> Formedium </td><td> CYN0402 </td></tr><tr><td> NaOHを</td><td>シグマ</td><td> S5881-500G </td></tr><tr><td>アデニン硫酸塩塩</td><td>シグマ</td><td> A3159-25G </td></tr><tr><td>寒天技術（第3号） </td><td>オキソイド</td><td> LP0013 </td></tr><tr><td> D-グルコース</td><td>シグマ</td><td> G7021-1KG </td></tr><tr><td> SC-浦ドロップアウト</td><td> Formedium </td><td> DSCK102 </td></tr><tr><td> FITC </td><td>シグマ</td><td> F7250-1G </td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム</td><td> BDH </td><td> 301215M </td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td> BDH </td><td> 102475W </td></tr><tr><td> PBS </TD&gt; <td>ギブコ</td><td> 18912-014 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>ロンザ</td><td> BE12-614F </td></tr><tr><td> FCS </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 10106169 </td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td>ロンザ</td><td> BE17-605E </td></tr><tr><td> LysoTrackerレッドDND-99 </td><td>インビトロジェン</td><td> L7528 </td></tr><tr><td> 35ミリメートルのガラス皿</td><td> PAA </td><td> PAA12305160X </td></tr></tbody></table>

live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis

真菌病原体、そしてより一般的に微生物の貪食クリアランスは、4つの段階から成ると考えられるかもしれません：病原体が配置されているサイトへの貪食細胞の（i）の移行、パターンを介して病原体関連分子パターン（PAMP）の（ii）の認識認識受容体（PRRS）;成熟ファゴソームと摂取した粒子の消化中に飲み込まれた細胞の（iii）の食細胞の細胞膜に結合した微生物の貪食、及び（iv）の処理。その全体を貪食を評価する研究は、1、2、3、4、5、有益ではありますが、通常は差動で影響を受ける可能性があり、移行、貪食とファゴソーム成熟へとプロセスを分解しないように制限されています。さらに、このような研究では、単一のイベントとしてではなく、連続的な動的プロセスとして取り込みを評価します。最近我々は、高度なライブセルイメージング技術を開発している、との両方の遺伝的機能解析とこれらを組み合わせている病原体と宿主細胞は、自然免疫細胞の機能と真菌病原性の分析のための学際的なプラットフォームを作成することができます。これらの研究では、唯一のより一般的には人間の食細胞および真菌病原体や感染性微生物の間の分子と細胞の相互作用を体系的に時間的な分析を用いて観察することができた貪食の小説の側面を明らかにした。例えば、私たちは、次の内容を定義し始めている：（a）細胞表面の成分が認識、貪食および真菌細胞1、6、7、8の殺害の過程の各段階で必要なこと、（b）どのように表面形状マクロファージの取り込みおよび酵母と菌糸細胞7の殺害の効率に影響を与えると、（c）は、貪食細胞周期およびマクロファージ9,10の行動の変化につながる方法。 単一の時点のスナップショットとは対照的に、ライブセルビデオ顕微鏡は、共として研究する宿主細胞や病原体の様々な可能細胞遊走、レプリケーションや小胞輸送などのダイナミックなプロセスの広範囲に空間的、時間的な情報を提供する長い期間にわたってntinuous配列。ここでは、ホストと真菌細胞を準備するために、ビデオ顕微鏡実験を実施する方法を詳細に説明します。これらのメソッドは、他の食細胞および微生物による将来の研究のため、ユーザガイドを提供することができます。

ここでは、Cの代表的な結果を示す6時間ライブセルビデオ顕微鏡実験中のマウスマクロファージ細胞株J774.1によるカンジダの取り込み。 図1は、Cの食作用を示す、代表的な生細胞ビデオ顕微鏡ムービーですネズミJ774.1マクロファージによるカンジダ 。ライブセルビデオ顕微鏡は、C.の内在化を可能にカンジダカンジダ外部を染色する必要がなく、可視化する。しかし、これらの実験中、C.カンジダは、マクロファージファゴソームの酸性化の間に急冷されるpH感受性色素FITC（緑）を使用して染色し、 カンジダが （ 図1）は、内在化されたことの確認を容易にしました。摂取した後の更なる援助の可視化へカンジダ、マクロファージは赤色蛍光色素LysoTracker赤DND-99、シミ酸性コンパートメントおよびファゴソーム成熟の非特異的マーカーとして機能を用いて染色した。図2は、ライブセルビデオ顕微鏡実験から静止画像であり、Cの数の変化を示してカンジダは、個々 の J774.1マクロファージによって摂取した。この実験では、J774.1マクロファージの82％が少なくとも1℃を巻き込ん6時間貪食アッセイの終了時アルビカンス細胞。 図3は 、内在化Cの数のマクロファージ当たりアルビカンス細胞が報告されている。 Cの平均数マクロファージあたり取り上げアルビカンスは 3.4であるが、興味深いことにマクロファージが16真菌細胞まで取り込むことができます。 図4は Cを貪食マクロファージを示す代表的なライブセルビデオ顕微鏡実験から静止画像の連続ですアルビカンス細胞 、マクロファージ、最終的にマクロファージ溶解による菌糸の成長図4は、ビデオ顕微鏡では、標的細胞の貪食、次のイベントの分析を可能にする、 すなわちデータが気に生成することができる示しC.によるマクロファージのlling摂取された標的細胞の数や形態形成に関連してカンジダ菌糸方法、およびマクロファージの殺害は、リアルタイムで調べることができるファゴソーム成熟に関する。 図1℃の貪食作用を示すライブセルビデオ顕微鏡映画ネズミJ774.1マクロファージによるカンジダ 。マクロファージは、赤色蛍光色素LysoTracker赤DND-99、 および C を用いて染色されているカンジダは、FITC（緑色）を用いて染色されています。マクロファージおよびC.カンジダは 、2独立培地を完全COで37℃で6時間の期間の間共培養した。画像は6時間1分間隔で撮影した。マクロファージはCで細胞間の接触を確立見ることができます次に Cの取り込みが続いているアルビカンス、マクロファージのファゴソームにカンジダ 。矢印は Cを指すJ774.1マクロファージによる貪食前にカンジダ 。このビデオでは、またFITC蛍光がquencであることを示していますCのHED以下呑食カンジダ 。スケールバーは、10μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50196/50196fig1.avi" target="_blank">ムービーを見るにはここをクリック</a> 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig2.jpg" /> 個々のマクロファージに飲み込まC.albicans数の図2代表的なライブセルビデオ顕微鏡静止画像表示バリエーション。マクロファージ（ステンド使用LysoTracker赤DND-99）は、FITC で染色されたと共培養したカンジダ·アルビカンス （緑）。 Cの数にばらつきがあるカンジダは （矢印の隣にある数字は、C. albicansの数が飲み込ま示します）のみ込ま、およびC でalbicansの形態（ すなわち酵母の詩菌糸）。スケールバーは20μm。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig3.jpg" /> 図3℃の数を示すグラフalbicansは 6時間貪食アッセイの終了時にマウスマクロファージJ774.1あたり摂取。データは、2つの独立した実験を表しています。 100マクロファージの合計は600個のマクロファージの合計を与えて、それぞれの実験からの3つのフィールドから数えた。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig4.jpg" /> 図4：代表的なライブセルビデオ顕微鏡マクロファージを示す実験（M）とCからの一連のイメージ認識（A、B）との間に事前アルビカンス （C）、および取り込み（C、D）の最中や後に。C. albicansの菌糸はマクロファージ溶解（G）になる可能性がマクロファージ（E、F）、内に成長を続けている。他のマクロファージは破裂してリリースされたCを摂取しようとする部位に補充されるカンジダ·アルビカンス （H）。マクロファージは、赤色蛍光色素を用いて染色LysoTracアールケール赤DND-99、 および C カンジダは、FITC（緑色）を用いて染色されています。 FITCの染色が C以下のクエンチされることに注意してくださいJ774.1マクロファージ（C）によりカンジダ取り込み。スケールバーは、10μmである。

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Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

我々は、のライブセルビデオ顕微鏡のための方法を説明します<em&gt;カンジダ·アルビカンス</emマクロファージによる&gt;貪食。これらのメソッドは、マクロファージ遊走、認識、貪食とファゴソーム成熟のステージ固有の分析を可能にし、食作用の新たな側面を明らかにする。

真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

live-cell-video-microscopy-of-fungal-pathogen-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

38.8K ビュー.  University of Aberdeen. 我々は、のライブセルビデオ顕微鏡のための方法を説明しますカンジダ·アルビカンス貪食。これらのメソッドは、マクロファージ遊走、認識、貪食とファゴソーム成熟のステージ固有の分析を可能にし、食作用の新たな側面を明らかにする。

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Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

2光子顕微鏡を用いて感染肺における好中球による貪食とNET -形成の直接観察

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

免疫・感染学

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

動的な生細胞イメージングのための宿主 - 病原体相互作用の研究のための光トラップの使用

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

ライブセル蛍光顕微鏡を用いた細菌毒素誘導される応答の可視化

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

機能研究のためのマウス骨髄好中球と養子移入実験の分離、精製とラベリング

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Alphaherpesウイルス順行性輸送とスプレッドの生細胞イメージング

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

の種特異的検出のためのLAMP法（LAMP）アッセイ<em&gt;アイメリア</em&gt;鶏に感染する

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

日和見菌病原体への蛍光タグ付き遺伝子のバイオリスティック変容<em&gt;クリプトコックス·ネオフォルマンス</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.